构建基因敲除细胞系:

文摘   2025-01-03 13:29   美国  

免费资源:

一、国自然类:


1 2023历年国自然标书全文

3 国自然项目答辩PPT

5 标书写作模板

7 GraphPad 9安装包

2 2018-24年国自然清单

4 基金插图素材(可编辑)

6 近10年国自然标书全文

二、SCI生信+实验类:

1 160套SCI实验操作视频

3 Meta分析范文+教程

5 泛癌分析万能代码

7 130套SCI实验视频

9 单细胞数据挖掘课

11 统计分析万能模板

2 100个SCI实验Protocol

4 miRNA预测靶基因代码

6 动物实验操作视频汇总

GEO/TCGA数据挖掘课

10 SCI写作万能模板

三、科研绘图类:

PPT科研绘图素材合集

3 Adobe illustrator绘图素材

5 动物实验矢量图素材

7 PS修各种SCI实验图视频

资源共享群

PPT科研绘图插件VIP版

4 各种实验仪器矢量图素材

6 细胞实验矢量图素材

AI科研绘图视频课

10 亲交友微信群


一、今日推送:
CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌和古细菌中天然适应性免疫机制的基因编辑工具。它利用Cas9蛋白和一种向导RNA(sgRNA)结合DNA靶点,从而实现对特定基因的敲除或敲降。其原理如下:

CRISPR-Cas9通过向导RNA(sgRNA)识别靶基因,并由Cas9蛋白切割靶DNA产生双链断裂。当sgRNA引导Cas9蛋白到达靶位点后,Cas9会检测靶位点下游是否存在特定的PAM(通常为5'-NGG-3'),且对PAM序列上游第3个碱基和第4个碱基之间进行切割:


随后,细胞通过非同源末端连接(NHEJ,易于引入插入或缺失突变(indels),导致靶基因编码框移位或功能丧失,达到敲除或敲降的目的。)修复引入突变,导致基因失活。

或通过同源定向修复(HDR,如果提供一个模板DNA,细胞可能利用该模板精确修复切口,用于定点突变或插入序列。)进行精确编辑。

我这里举一个例子,如下,比如你的DNA如下,你的sgRNA是靶向GGGCAAGAACGGGGTATTCG:

(snapgene软件安装包点击下载)

那后面的TGG就是PAM序列。cas9蛋白会对PAM序列上游3和4碱基(即TT之间)之间进行切割。那切割之后就是----GGGCAAGAACGGGGTAT     TCG----。同时切开后细胞会对DNA进行NHEJ修复。这个时候切口两边的T都可能丢失掉。随后最后你的细胞的DNA最终变为了GGGCAAGAACGGGGTATCG,减少了一个T,也就是发生了移码突变,你的DNA就不会转录出RNA,也不会翻译得到蛋白质了,也就是基因敲除。这只是你筛选的单细胞的一种可能,可能你筛选了50个单细胞,长到6cm皿后做PCR检测序列的时候可能有很多种可能:


目前,比较商业化的CRISPR-Cas9质粒是57818质粒:


这个质粒带有EGFP荧光,sgRNA酶切位点和Cas9蛋白。这个质粒一般是通过BsmBI酶切两个位点切开后,将目的sgRNA替换上去,从而完成目的CRISPR-Cas9质粒的构建:


下面我们教大家如何构建sgRNA质粒(已经验证过的,放心使用)。首先是sgRNA设计(www.swyxzj.com,生物医学之家):


那,GAGACGTGCGAGAAACTCAA是靶向的DNA序列,靶向的是WNT4基因的第二个外显子,非常不错,不过最理想的是靶向第一个外显子,这样我们移码突变的效果最好。最后我们需要订购的oligo就是(两边是bsmbi连接序列,所以下面这个序列是万能序列,你只要替换中间的sgRNA序列就行,因为酶切位点连接位点是一样的):


两条oligo,订购的时候记得告诉公司,每一条oligo都需要5端磷酸化(因为有了这个修饰,我们后面才能连接到切开的57818质粒上,没有磷酸化就不能连接或者说连接效率低下)。为了方面做好记录,我们可以将这个sgRNA模拟出来,如下用snapgene,点击action---anneal oligo:


那有个这两个片段,我们就可以模拟最后构建好的57818-WNT4sgRNA质粒,如下:


点击action-insertion cloning--insert fragment:



最后这就是我们的完整质粒啦:



OK,以上为理论,现在我们要开始讲实验啦。首先是订购的单链oligo退火形成双链,体系如下:


GE100007是货号,95到25度,每下降5度后呆5分钟,一直到25度,大约是70分钟。

随后是57818的bsmbi酶切,要注意bsmbi这个酶需要新鲜的DTT,同时这两个位点太近了,所以需要加入FastAP防止自连。37度酶切1.5小时。然后65度20分钟停止酶切和75度5分钟抑制FastAP活性,随后将酶切产物跑胶1.5小时,胶回收,最后测DNA的浓度:


最后是连接,首先将退火的sgRNA双链稀释200倍后用于下面的实验。加入的体系如下(ps:这个体系也是万能体系,反正就是加入100ng的酶切空载,所以你需要修改的就是5.6ul这个数字,根据你自己的来):


16度酶切16小时,65度10分钟终止酶切。最后就是转化,将质粒转化到大肠杆菌中。从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞DH5a 50uL,室温下置于冰盒上解冻5-10分钟,标记;向感受态细胞中加入5µl的质粒,置于4℃冰箱中,冰浴30min;在42℃水浴锅中热激90s,然后立即在冰盒上放置2min;每管加450µl  LB培养基,37℃摇床震荡,220rpm×45min;取100µl 转化液加入对应抗性(这里是AMP+,氨苄抗性)的平板中,涂匀液体;将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。


最后就是挑取单克隆摇均提取质粒后送公司测序,给公司质粒,并告诉公司用U6-F或者LKO.15测序就行,一般测一个循环1000bp左右:


等你的测序结果一回来就如下比对即可:


好了关注我们吧,下次我们教大家用这个质粒包病毒,病毒感染细胞哦。此外,今天,我们要给大家免费发送:


“细胞分子实验培训课(理论+实操,原价6785元)”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:6785


基因表达水平检测PCR,qPCR,WB,基因敲降shRNA,基因敲除sgRNA,细胞转染,抗体制备,流式,测序,蛋白互作IP/COIP,ChIP,磷酸化WB,包病毒等一次性通通学会,还有很多经验的教学也是非常重要,比如你知道做PCR的时候GC含量很高就很难PCR出来,那其实现在商家早就解决了这种问题, 比如NEB公司的NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix,80%的GC含量我都PCR出来了,做了20个样,每个都P出来了。课程目录如下:



总之,系统性的学习比到处百度好的多。


“细胞分子实验培训课(理论+实操,原价6785元)”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:6785



二、资源免费送:

那我们把今年培训的国自然内部资料一次性免费发送给大家(新手完全可以按照别人中过的标书模仿着写,老手也可以参考别人标书中的套路是怎么回事):


“2018-2024国自然标书清单+标书全文+答辩PPT(原价7878元)”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:7878


这些标书都是全网首发,第一次发送出来,需要的赶紧收藏起来吧。资源如下



一、2018-2024国自然中标项目清单:



比如生科院和医学院的:



如医学部有1万左右:



二、国自然中标项目标书全文:


这都是已经中标的标书全文,对我们参考非常有用,部分截图如下:


(模糊截图,高清请下载)


三、几十套杰青、优青申报PPT(可编辑)


对于申报杰青、优青、长江的科研人员,一份已中的PPT模板可以很好的参考,思路逻辑格式等等:



比如优青答辩PPT:



再比如杰青的答辩:



好了,这些资料我们都已经打包好了放在百度云了,大家赶紧保存到自己的百度云中吧,非常有用。



“2018-2024国自然标书清单+标书全文+答辩PPT(原价7878元)”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:7878

三、免费资源:

顶级CNS插图如下:



但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。


所以,今天小编给大家免费赠送:


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”


生物医学之家CNS插图素材部分截图如下:



这些素材都是用Adobe illustrator绘制的,打开后可以继续编辑修改,这些素材原价是9999元的,现在免费给大家送永久账户。如下免费获取永久VIP账户:


🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP


免费发送1万个永久VIP账户,有了这个账号之后,你可以无限、永久下载生物医学之家的CNS插图素材。共有1万张素材,囊括了各种生物、人体组织、细胞、病毒、植物等。素材首页如下:



一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型,那就直接搜索鼠,有几百张小鼠插图就出现了:



有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图:



可以随意修改颜色:



也可以随意修改大小:



Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中,并对齐:



随后画一条线,示意要D369打药:



随后添加字体,这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。



最后保存和导出,一定要记得保存,保存就是矢量图了,以后还能修改。导出就是导出为图片,用来讲PPT或者投稿。



还在等什么?赶快免费获取账号呀,发SCI、作图的时候肯定用得着。


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP


还有,我们下载的素材,也可以右键取消分组:



然后修改任何一个你想要修改的元素,比如修改液体的颜色:



也可以将注射器放在背上,模拟皮下注射:



还可以将小鼠变为黑色:



还在等什么?赶快免费获取账号呀,发SCI、作图的时候肯定用得着。


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP


二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞:



有了这些素材,分分钟就可以绘制如下这种高分插图:



三、各种Nature插图原图:



下载下来之后每个细微的元素都可以修改:




我们一共上传1万张Nature插图。大家赶紧获取永久VIP账户吧,投稿绘图的时候用得着:


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”

如下免费获取:

🔽①长按下方二维码关注🔽

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP

②输入关键词:永久VIP

更多免费资源:

三、科研绘图类:

1 GraphPad绘图模板

50套R绘图万能代码

直装版PS+AI安装包

医学统计分析R版

9 单样本RNAseq分析

11 SnapGene序列比对

13 Endnnote安装包

15 R语言绘图模板

17 中文版RNAseq教程

19 Image J图片处理视频

21 更多资源在更新中.....

2 600套PPT模板

4Origin绘图模板

SPSS统计分析模板

8 铜铁死亡分析代码

10 m6A甲基化分析代码

12 qPCR计算模板

14 英文简历模板

16 R各种统计分析模板

18 46套生信分析代码

20 Sigma plot绘图软件和视频

四、生信和写作类:

1 ChIPqPCR引物设计

3 过表达引物设计

零代码复现6分SCI教程

零代码复现4分SCI教程

WGCNA分析课程

11 GO分析傻瓜式教程

13 GSEA分析傻瓜式教程

15 渐变火山图傻瓜式教程图

17 GEO+TCGA数据挖掘课

19 41GB的生信分析+实验资源

2 shRNA设计

4 Crispr-csa9素材

零代码复现5分SCI教程

8分SCI零代码复现步骤

10 超全生信数据库使用教程

12 KEGG富集分析教程

14 Meta分析范文+实操课

16 交集基因筛选高级教程

18 生信软件合集

辛苦整理,全文无任何广告!

觉得有用的话,您就点个在看、点赞!

科研之地
由Harvard Medical School及国内高校硕博们创办,一个共享生物医学科研资源的平台!
 最新文章