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中山大学宋尔卫/苏士成团队Nature最新研究成果，被质疑：
中山大学宋尔卫院士团队发表在Nature杂志上的一篇研究论文《肿瘤环状RNA通过编码隐蔽肽激发抗肿瘤免疫》。![]()
肿瘤细胞特异性表达的新抗原是肿瘤特异性抗原(TSAs)的主要来源，TSAs通过细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)诱导适应性抗肿瘤免疫。鉴定或筛选抗原肽是开发各种抗肿瘤免疫疗法的关键一步，包括肿瘤疫苗和工程T细胞疗法等。以前的工作主要集中在蛋白质编码基因组中的非同义突变来鉴定TSAs。然而，很大比例的人类癌症在蛋白质编码基因组中表现出较低的肿瘤突变负荷，只有一小部分突变的蛋白质编码基因具有足够的抗原性以引起免疫反应。因此，探索识别触发T细胞反应的肿瘤特异性抗原肽的替代方法对于有效的癌症免疫治疗至关重要。该研究提供了证据，表明自然形成的环状RNA可以通过非典型翻译隐抗原肽而具有高度免疫原性。由于恶性细胞中环状RNA的丰度和特异性，环状RNA编码的肽不同于正常组织中普遍存在的线性RNA编码的肽。这强调了当前发现的重要性，即肿瘤特异性环状RNA能够在启动肿瘤抗原特异性T细胞的初始阶段引发抗肿瘤免疫反应，从而增强效应免疫细胞。然而，在自然临床条件下，肿瘤相关DCs的隐抗原呈递和T细胞启动可能会受到免疫抑制肿瘤微环境的阻碍，这可能会抑制抗原呈递细胞的募集、抗原捕获、成熟、抗原交叉呈递和淋巴结迁移。因此，使用由肿瘤特异性环状RNA编码的隐性抗原肽甚至环状RNA本身的治疗性疫苗策略可以促进抗原呈递并刺激适应性免疫，从而有效地控制肿瘤。可这篇论文却在学界引发了不小的热议！在PubPeer网站上的评论，不乏对该研究的方法和结果提出了质疑。有位名为“Hemieuryale pustulata”的评论者指出：论文中关于circRNA疫苗合成部分存在可疑之处。他们质疑使用T4ssRNA连接酶1和短的互补无间隙DNA作为RNA环化的方法，认为这种方法在理论上是行不通的。此外，他们还指出，合成的circFam53b IVT起始序列“AAAA”与T7 RNA聚合酶偏好的“GG”转录起始序列相悖。评论者还提到，合成circRNA的数据完全缺失，包括凝胶分析、质量检查和IVT模板序列，这被认为是不专业和不可接受的。对此，评论者“Compsaraia samueli”也表达了类似的观点，他认为T4 RNA连接酶1不具备使作者所提出的方法能够创建环状RNA的活性。他们指出，即使是NEB网站也显示，该酶无法在完全互补的RNA-DNA杂交体中催化ssRNA末端的镍连接。另外，他们还提到，作为连接指南的DNA寡核苷酸实际上应该阻止上述的环状RNA的产生。以上这些对科学研究的质疑和讨论，充分展现了科学研究中的严谨性和批判性思维的重要性。同时，也反映出学界对于高影响力期刊上发表的研究成果的持续关注和审视，这是保证学术公正、权威的重要环节。每一位科学工作者都扮演着重要的角色，共同推动着科学的发展和进步。而面对上述种种质疑声，宋院士团队目前尚未做出任何回应----(下滑查看更多)
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比如生科院和医学院的：
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如医学部有1万左右：
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二、国自然中标项目标书全文:
这都是已经中标的标书全文，对我们参考非常有用，部分截图如下：
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（模糊截图，高清请下载）
三、几十套杰青、优青申报PPT（可编辑）
对于申报杰青、优青、长江的科研人员，一份已中的PPT模板可以很好的参考，思路逻辑格式等等：
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比如优青答辩PPT：
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再比如杰青的答辩：
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好了，这些资料我们都已经打包好了放在百度云了，大家赶紧保存到自己的百度云中吧，非常有用。
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CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌和古细菌中天然适应性免疫机制的基因编辑工具。它利用Cas9蛋白和一种向导RNA（sgRNA）结合DNA靶点，从而实现对特定基因的敲除或敲降。其原理如下：CRISPR-Cas9通过向导RNA（sgRNA）识别靶基因，并由Cas9蛋白切割靶DNA产生双链断裂。当sgRNA引导Cas9蛋白到达靶位点后，Cas9会检测靶位点下游是否存在特定的PAM（通常为5'-NGG-3'），且对PAM序列上游第3个碱基和第4个碱基之间进行切割：随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ，易于引入插入或缺失突变（indels），导致靶基因编码框移位或功能丧失，达到敲除或敲降的目的。）修复引入突变，导致基因失活。或通过同源定向修复（HDR，如果提供一个模板DNA，细胞可能利用该模板精确修复切口，用于定点突变或插入序列。）进行精确编辑。我这里举一个例子，如下，比如你的DNA如下，你的sgRNA是靶向GGGCAAGAACGGGGTATTCG：![]()
那后面的TGG就是PAM序列。cas9蛋白会对PAM序列上游3和4碱基（即TT之间）之间进行切割。那切割之后就是----GGGCAAGAACGGGGTAT TCG----。同时切开后细胞会对DNA进行NHEJ修复。这个时候切口两边的T都可能丢失掉。随后最后你的细胞的DNA最终变为了GGGCAAGAACGGGGTATCG，减少了一个T，也就是发生了移码突变，你的DNA就不会转录出RNA，也不会翻译得到蛋白质了，也就是基因敲除。这只是你筛选的单细胞的一种可能，可能你筛选了50个单细胞，长到6cm皿后做PCR检测序列的时候可能有很多种可能：![]()
目前，比较商业化的CRISPR-Cas9质粒是57818质粒：![]()
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这个质粒带有EGFP荧光，sgRNA酶切位点和Cas9蛋白。这个质粒一般是通过BsmBI酶切两个位点切开后，将目的sgRNA替换上去，从而完成目的CRISPR-Cas9质粒的构建：![]()
下面我们教大家如何构建sgRNA质粒（已经验证过的，放心使用）。首先是sgRNA设计(www.swyxzj.com，生物医学之家)：![]()
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那，GAGACGTGCGAGAAACTCAA是靶向的DNA序列，靶向的是WNT4基因的第二个外显子，非常不错，不过最理想的是靶向第一个外显子，这样我们移码突变的效果最好。最后我们需要订购的oligo就是(两边是bsmbi连接序列，所以下面这个序列是万能序列，你只要替换中间的sgRNA序列就行，因为酶切位点连接位点是一样的)：![]()
两条oligo，订购的时候记得告诉公司，每一条oligo都需要5端磷酸化（因为有了这个修饰，我们后面才能连接到切开的57818质粒上，没有磷酸化就不能连接或者说连接效率低下）。为了方面做好记录，我们可以将这个sgRNA模拟出来，如下用snapgene,点击action---anneal oligo:
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那有个这两个片段，我们就可以模拟最后构建好的57818-WNT4sgRNA质粒，如下：
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点击action-insertion cloning--insert fragment:
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最后这就是我们的完整质粒啦：
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OK，以上为理论，现在我们要开始讲实验啦。首先是订购的单链oligo退火形成双链，体系如下：![]()
GE100007是货号，95到25度，每下降5度后呆5分钟，一直到25度，大约是70分钟。
随后是57818的bsmbi酶切，要注意bsmbi这个酶需要新鲜的DTT，同时这两个位点太近了，所以需要加入FastAP防止自连。37度酶切1.5小时。然后65度20分钟停止酶切和75度5分钟抑制FastAP活性，随后将酶切产物跑胶1.5小时，胶回收，最后测DNA的浓度：
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最后是连接，首先将退火的sgRNA双链稀释200倍后用于下面的实验。加入的体系如下（ps：这个体系也是万能体系，反正就是加入100ng的酶切空载，所以你需要修改的就是5.6ul这个数字，根据你自己的来）：
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16度酶切16小时，65度10分钟终止酶切。最后就是转化，将质粒转化到大肠杆菌中。从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞DH5a 50uL，室温下置于冰盒上解冻5-10分钟，标记;向感受态细胞中加入5µl的质粒，置于4℃冰箱中,冰浴30min;在42℃水浴锅中热激90s，然后立即在冰盒上放置2min；每管加450µl LB培养基，37℃摇床震荡,220rpm×45min；取100µl 转化液加入对应抗性（这里是AMP+,氨苄抗性）的平板中，涂匀液体；将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。![]()
最后就是挑取单克隆摇均提取质粒后送公司测序，给公司质粒，并告诉公司用U6-F或者LKO.15测序就行，一般测一个循环1000bp左右：![]()
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好了关注我们吧，下次我们教大家用这个质粒包病毒，病毒感染细胞哦。此外，今天，我们要给大家免费发送：
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可以随意修改颜色：
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也可以随意修改大小：
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Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中，并对齐：
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随后画一条线，示意要D369打药：
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随后添加字体，这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。
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最后保存和导出，一定要记得保存，保存就是矢量图了，以后还能修改。导出就是导出为图片，用来讲PPT或者投稿。
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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞：
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三、各种Nature插图原图：
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