温故知新｜促红细胞生成素对早产儿外周血循环中造血祖细胞的作用
学术
育儿
2024-07-01 17:03
北京
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引用格式：肖娟,王丹华,刘艳云,等. 促红细胞生成素对早产儿外周血循环中造血祖细胞的作用[J]. 中华围产医学杂志,2009,12(01)：24-27. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2009.01.007作者单位:100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院儿科(肖娟、王丹华),血液科(汪玄); 黑龙江省双鸭山市人民医院儿科(刘艳云) 【摘 要】
目的 研究促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗早产儿贫血的安全性及有效 性,并对其治疗早产儿贫血的内在机制进行探讨。方法 对24例贫血早产儿进行随机对照的前瞻 性研究,治疗组和对照组各12例。治疗组除采用对照组的常规疗法外,另给予 EPO250U/(kg· 次),3次/周,皮下注射,共4周。EPO 治疗前及治疗2周时应用半固体培养的方法分别对两组外周血中各系造血祖细胞形成的集落数进行比较分析,并对治疗期间的白细胞总数、中性粒细胞绝对值、 淋巴细胞数、单核细胞数、血小板数及网织红细胞、血红蛋白等进行比较。 结果 EPO 治疗前治疗 组与对照组的红系集落形成单位、红系爆式集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位、混合集落形成 单位和巨核细胞集落形成单位的集落数差异无统计学意义(P>0.05)。而治疗2周时,治疗组红系 集落形成单位为(57±20)个,明显高于对照组[(34±13)个](P<0.05);治疗组与对照组相比较,治疗期间白细胞总数、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞数、单核细胞数及血小板数均无明显的变化(P> 0.05),而治疗组治疗1、2、3、4周后,网织红细胞数及血红蛋白均有显著提高(P<0.05);治疗第4周 时,治疗组的血红蛋白高于对照组[(152±14)g/L,(128±11)g/L,P<0.05]。 结论 从祖细胞水 平及临床水平均证明了 EPO 治疗早产儿贫血的安全性及有效性。EPO 可能作用于早产儿的红系晚期造血祖细胞及其以后阶段,进而使血红蛋白升高。 【关键词】 婴儿,早产,疾病;贫血;造血干细胞;红细胞生成素所有早产儿在生后前几周均会出现不同程度的血红蛋白下降,而且出生体重越低,贫血程度越严重,持续时间也越长。早产儿贫血传统的治疗方法 是输血,但输血存在潜在的危险性。国内外已有应用促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)治疗早产儿贫血的报道[1-2]。EPO 可促使更多的多能干细胞定向向红系造血祖细胞转化,进而生成成熟的红细胞,从而使外周血网织红细胞 (reticulocyte,Ret) 及血红蛋白(hemoglobin,Hb)明显提高[3]。但同时对多能干细胞的竞争可能使粒细胞减少,从而导致中性粒细胞减少或缺乏症。Halpérin [4]发现临床中应用 EPO 后出现暂时性中性粒细胞下降及血小板数上升,临床上有使感染、血栓增多的趋势。那么, EPO 究竟作用于早产儿的多能造血干/祖细胞还是红系祖细胞? 如何使 Hb上升? 是否导致临床感染机会增加? 是否导致血栓形成的机会增加? 本研究从造血祖细胞水平研究EPO 的作用,并对其防治早 产儿贫血的内在机制进行了探讨。研究对象为2002年1月至2005年12月在我院住院的早产儿。入选标 准:胎龄 <34 周、体重 <1800g的早产儿。排除标准:(1)研究期间需要机械通气或持续气道正压辅助呼吸或吸入氧浓度> 40%者。(2)不能坚持完成EPO4周疗程者。治疗组共募集早产儿16例,4例因未完成4周 EPO 疗程退 出研究。研究对象均在生后3~11d内随机分组,最终每组12例。治疗组应用EPO,对照组不用EPO。 1.EPO 的使用:治疗组 EPO (宁红欣,南京华欣药业生物工程有限公司提供)250U/(kg·次), 3次/周,皮下注射,共4周。同时口服硫酸亚铁,开始为元 素铁2 mg/(kg·d),逐渐增至6mg/ (kg·d);VitE5 mg,Bid;叶酸0.5 mgQd;VitB12 100μg,肌注,1次/4周。对照组除不用 EPO 外,其余与治疗组相同。2.造血祖细胞培养:分别于用药前及开始用药 后2周时做造血祖细胞的培养。培养方法:(1)单个核细胞分离:研究对象取静脉血1~1.5ml肝素抗凝,适当 PBS稀释后叠加于 Ficoll淋巴细胞分离液 (比重1.077)上,400r/min离心25min,吸取单个 核细胞层,PBS洗涤2次后备用。(2)甲基纤维素半固体培养:培养基的准备参照文献[5],IMDM培养 基终浓度:30%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、0.9% 甲基纤维素、干细胞因子 50 ng/ml、EPO 2.5U/ml、粒-巨噬细胞集落刺激因子40ng/ml和白细胞介素-3(interleukin-3, IL-3)50ng/ml。上述培养基及上述分离的单个核细胞 1×105/ml混匀 后加入24孔板中(0.3~0.5ml/孔),每份标本重复两孔。将培养体系置于37 ℃、5%CO2 饱和湿度的培养箱内培养。于倒置显微镜下计数集落,按其形态辨认不同类型的集落。红系集落形成单位(colony forming unit-erythroid,CFU-E)(>7个细胞的 细胞团)在培养第5~7天时计数。红系爆式集落形成单位(burst forming unit-erythroid,BFU-E)(> 50个细 胞 的 细 胞 团)、粒-巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte/macrophage, CFU-GM)(>40个细胞的细胞团)及混合集落形成 单位(colonyformingunit-Mix,CFU-Mix)(>50个 细胞的细胞团)在第10~14天时计数。部分集落以 10μl加样枪吸出涂片做瑞士染色以明确集落的类 型。(3)巨核细胞集落形成单位 (colonyforming unit-megakaryocyte,CFU-MK)参照文献[6]应用血浆凝块体系进行。上述分离的单个核细胞 1× 105/ml加入IMDM 体系(10%牛血浆、10% 胎牛血 清、1% 牛血清白蛋白、0.34 mg/ml CaCl2、 50ng/ml促血小板生成素和20ng/mlIL-3)。经过 12~14d培养后,培养基自然风干、固定,以CD61- FITC的单抗进行荧光染色,然后在荧光显微镜下计数 CFU-MK(≥3个细胞的细胞团)。 3.检测指标:于用药前及开始用药后4周内每周测定1次血常规及网织红细胞,共5次。白细胞 (white blood cell,WBC)、红细胞 (red blood cell, RBC)及血小板(platelet,PLT)数通过自动血细胞计数仪测定,中性粒细胞绝对值通过 WBC 总数及血涂片中中性粒细胞数所占比例计算得出。 应用统计软件SPSS10.0进行分析。正态分布计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。 两组早产儿的出生体重、胎龄、入组日龄以及血常规中各项指标,包括:Ret、Hb、WBC、中性粒细胞绝对值及 PLT 等的差异均无统计学意义(表1),两组具有可比性。 二、两组在治疗开始前及治疗2周时外周血造 血祖细胞数(或形成集落数)的比较 早产儿外周血循环中不仅含有一定数量的CFU-GM 及 CFU-E、BFU-E,也含有一定数量 的 CFU-Mix。治疗2 周时,治疗组的 CFU-E 明显高于对照组,差异有统计学意义。见表2。 三、两组在治疗第1、2、3、4周时血细胞计数的比较 在4周治疗过程中,治疗组与对照组的白细胞总数、淋巴细胞数及中性粒细胞绝对值的差异均无统计学意义。见表3。 四、两组在治疗第1、2、3、4周时血小板数及网 织红细胞、血红蛋白数值的比较 在4周治疗过程中,治疗组与对照组血小板数差异无统计学意义。治疗组 Ret及 Hb均比对照组明显提高,差异有统计学意义。见表4。 ![]()
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早产儿贫血常发生于出生后4~8周的早产儿, 尤其是极低出生体重儿贫血发生的更早,程度也更 重,严重影响早产儿的生活质量。EPO 的应用翻开 了早产儿贫血治疗的新篇章。本研究从造血祖细胞 水平及临床水平评价了 EPO 治疗早产儿贫血的安全性和有效性。 血细胞的增殖分化是在一系列细胞因子的调节下完成的,其中与红细 胞发育成熟关系密切的是EPO。EPO 的合成释放受多种因素调节和控制,其中组织缺氧是刺激 EPO 合成释放的主要因素。动物实验和临床研究发 现,早产儿贫血期间,血 中 EPO 浓度增加明显低于成人或儿童同等程度贫血 者水平,而且胎龄越小,EPO 浓度越低[7-8]。目前认为这可能与EPO 产生的部位有关。动物实验表明, 哺乳类动物在宫内最先由肝脏产生 EPO,在胎龄 30周时开始逐渐向肾脏转移,这种转移大约在生后 40d完成[9]。极低出生体重儿由于发育不成熟,生后前几周产生部位主要在肝脏,而肝脏对缺氧较肾 脏不敏感,因此产生 EPO 较少。 本研究显示给予EPO 治疗后,早产儿循环池中红系晚期祖细胞 CFU-E 较对照组明显增多,说明 早产儿贫血是由于 EPO 产生不足而非红系祖细胞 对 EPO 反应异常所致,从而为临床上应用 EPO 治疗早产儿贫血提供了理论依据。 本研究发现早产儿循环池中确实存在一定数量的CFU-Mix、CFU-MK、BFU-E、CFU-E 及 CFU GM,CFU-Mix的数量表示尚未定向的多能干细胞 或多能祖细胞数,BEU-E 表示早期红系祖细胞数, CFU-E表示晚期红系祖细胞数,CFU-GM 表示粒- 巨噬系祖细胞数,CFU-MK 表示巨核系祖细胞数, 而各阶段红系祖细胞的存在为 EPO 作用于各阶段细胞的研究奠定了基础。 成熟红细胞是由造血干细胞分化增殖而来。干细胞先形成 CFU-Mix,然后定向为 BFU-E,分化成 CFU-E,再进一步分化成原始红细胞,幼稚红细胞, 网织红细胞,直至成熟的红细胞。EPO 产生之后随血循环至骨髓并结合至祖细胞的特殊细胞表面受体,各种细胞对EPO 的敏感度随他们的分化阶段的变化而变化。本研究发现 EPO 治疗组的 CFU-Mix 及 BFU-E、CFU-GM、CFU-MK 与对照组差异无统计学意义,而CFU-E明显高于对照组,说明EPO 对早产儿的作用环节可能在红系晚期祖细胞及其以下 阶段细胞,从而促进更多的成熟红细胞生成。文献报道,对慢性肾功能衰竭的成人患者注射 EPO 后, 循环池中 CFU-Mix、BFU-E、CFU-E 均明显升高, 说明成人EPO 的效应细胞不同于早产儿,可能为早期的造血干细胞及红系早期祖细胞[10-11]。 本研究表明EPO 主要作用于红系晚期祖细胞, 对 CFU-Mix无明显作用,并不存在使早期多能干/ 祖细胞向红系祖细胞转化而竞争性使粒系祖细胞减 少的问题。研究显示CFU-GM 在EPO 治疗前后较 对照组并无下降,且分化成熟为中性粒细胞的绝对值也无明显下降。此结果与国外文献报道一致[9]。因此,粒细胞从祖细胞到成熟细胞阶段均无明显下降,说明应用 EPO 治疗的安全性,并没有使临床感染增加的危险。与对照组相比,治疗组的 CFU-MK 及血小板数虽然均高于对照组,但无统计学意义。关于 EPO 对早产儿的 CFU-MK 的作用文献报道极少,本研 究从祖细胞水平说明应用 EPO 治疗不会增加血栓形成的危险,这可能也与EPO 主要作用于红系晚期祖细胞有关。综上所述,本研究从祖细胞水平上及临床上均证实了使用 EPO 治疗早产儿贫血的安全性及有效性。因此,EPO 为防治早产儿贫血的可靠措施,应 该推广其在临床的应用。 ![]()
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