透明质酸微生物发酵上游工艺

一、菌种选择

HA主要由链球菌属，如兽疫链球菌、马疫链球菌等，特别是马链球菌兽疫亚种合成。链球菌是一种革兰氏阳性细菌，具有多样性和异质性。优先选择安全非人体致病菌且能产生高质量的透明质酸菌株。通过诱变育种等方法，筛选出高产、遗传稳定且无溶血性的菌株。

表 1.不同微生物以不同的代谢途径在不同发酵培养基中生产HA

目前通过基因工程插入与 HA 合成相关的必需基因和独特的纳米颗粒已被用于增加 HA 的产生。在某些情况下，甚至可以通过部分抑制糖酵解途径，将碳通量转向 HA 的生产，从而使HA的产量增加七倍，但这相应也会使产品的分子量同时增大，生产相对均匀长度的 HA成为一个新的挑战。此外，随着高密度发酵，培养基粘度超过 4 g/L的HA 会限制氧气转移，从而形成厌氧环境，使碳流更多地流向生物质的生产，而不是HA，从而产生相应的污染副产物，如乳酸。

图1.马链球菌兽疫亚种A群和C群透明质酸(HA)生物合成代谢流图（通过基因工程手段，将S. zooepidemicus的相关基因插入L. lactis中，创建了能够生产HA的重组菌株）

HA的生物合成起始于葡萄糖，通过己糖激酶将其转化为葡萄糖-6-磷酸（葡萄糖-6-P），这是HA合成的关键前体。随后，葡萄糖-6-P进入两条不同的合成途径：第一条途径形成葡萄糖醛酸：葡萄糖-6-P在磷酸葡萄糖变位酶的作用下转化为葡萄糖-1-P，再由UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化生成UDP-葡萄糖。UDP-葡萄糖经过UDP-葡萄糖脱氢酶的氧化，形成UDP-葡萄糖醛酸，这是HA的第一个前体。第二条途径形成N-乙酰葡萄糖胺：葡萄糖-6-P在磷酸葡萄糖异构酶的作用下转化为果糖-6-磷酸，经酰胺转移酶标记上酰胺基后形成葡萄糖胺-6-磷酸。葡萄糖胺-6-磷酸再经酶变位酶修饰为葡萄糖胺-1-磷酸，最后经乙酰转移酶和焦磷酸化酶乙酰化、磷酸化，形成UDP-N-乙酰葡萄糖胺，这是HA的第二个前体。这两种前体在透明质酸合酶的催化下，以交替模式聚合，最终形成透明质酸聚合物。对于细菌而言，HA的生物合成是一个耗能且复杂的过程，同时利用了许多糖酵解产生的中间体。正确了解HA的生物合成途径，有助于优化发酵技术，提高HA的产量。

图2.马链球菌兽疫亚种(S. zooepidemicus)中透明质酸(HA)的生物合成

对筛选出的菌种进行斜面培养，制备斜面种子。下一步就是进行摇瓶种子培养，扩大菌种规模，为后续的发酵培养提供足够的接种量。

三、发酵培养基的优化

1.碳源：葡萄糖是最佳的碳源，因其易于被菌体分解利用，产生高量的透明质酸。蔗糖、麦芽糖和果糖等也可被利用，但效果不如葡萄糖。木糖和半乳糖的利用效果较差，不适合作为碳源。

2.氮源：酵母膏是最佳的氮源，含有大量菌体生长所需的生长因子。酵母膏和蛋白胨的混合氮源效果次之。无机氮源（如硫酸铵）效果最差，不适合作为氮源。

3.其他营养成分：添加适量的无机盐（如KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O）以提供菌体生长所需的微量元素。

4.培养基pH值：初始pH值应调至7.0左右，这是菌体生长和透明质酸合成的最佳pH值。

四、发酵条件的控制

1.温度：发酵温度应控制在35℃-38℃左右。温度过高或过低都会影响菌体的生长和透明质酸的产量。

2.溶氧水平：通过调整搅拌转速和通气量来维持发酵液中的溶氧水平，一般在40%-50%，溶氧水平的高低直接影响菌体的生长和透明质酸的合成。

3.pH值监控：在发酵过程中定期检测pH值，并根据需要进行调整。pH值的稳定对菌体的生长和透明质酸的合成至关重要。

4.搅拌转速：200-650rpm，对于HA发酵搅拌在发酵过程中有两个作用，一为搅拌混合作用，强化气液间的氧的传递，既维持发酵液中有足够的溶氧，为细胞提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利细胞的吸收和利用；另一为剪切作用，既影响细胞的生长，又可加速细胞荚膜从细胞表面脱离，从而影响丝状大分子的分子量。

5.补料：补料可以维持菌体的生长活力和透明质酸的持续合成。根据菌体的生长情况和透明质酸的合成速率，有研究发现初始培养基中糖的浓度和发酵后期糖浓度的维持对HA的产量具有直接相关性。

6.发酵时间：发酵时间应根据菌种的生长特性和透明质酸的合成速率来确定。一般情况下，发酵时间为18-40h左右。

7.装量：发酵液的装量应控制在一定范围内，以保证溶氧的充足和发酵过程的顺利进行。装量过大或过小都会影响透明质酸的产量。

五、发酵模式和工艺对HA产量的影响

目前有不同发酵模式如：分批、连续分批、补料分批等方法。要提高代谢物产量，可通过连续/补料分批模式控制特定生长率，以克服其对代谢产物的潜在干扰。相较于传统的分批生产方式，补料分批模式已显示出缩短发酵时间和提高产量的优势。此外，连续发酵模式有助于延长生长周期，减少浪费，并降低HA的分子量多分散性。为了优化HA的生产，采用了两阶段发酵策略，其中初始阶段注重提高HA的分子量，而积累阶段则关注HA的积累。通过调整发酵温度和pH值，实现了HA产量的优化。

表2：链球菌在不同发酵模式和工艺条件下HA的产量

六、未来展望

国内透明质酸生产发展迅速，华熙生物作为全球最大生产商，高分子透明质酸发酵产率达12-14g/L，小分子透明质酸产率可达70g/L，达到国际领先水平。2021年销量占全球44%，并创新酶切法生产寡聚透明质酸。工艺上，国内企业不断升级，运用基因工程、纳米技术等提升效率和质量，同时产品也呈现出多样化的趋势。总体来看，国内透明质酸产业领先全球，也相信未来会涌现出更多优秀的企业和更完美的上游工艺策略。