温故知新｜雌激素受体基因多态性与妊娠期肝内胆汁淤积症关系的研究
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2024-07-30 17:02
北京
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引用格式：梁正仪,刘淮. 雌激素受体基因多态性与妊娠期肝内胆汁淤积症关系的研究[J]. 中华围产医学杂志,2007,10(06)：365-369. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2007.06.002基金项目：江西省科技厅科技攻关项目(项目编号： Z005180301900) 【摘 要】
目的 研究雌激素受体a(estrogen receptor a，ERh)基因多态性表达，探讨ER基因多态性与江西籍汉族人群妊娠期肝内胆汁淤积症(intmhepatic chol鹤tasis of pregnancy，ICP)的相关关系。
方法 应用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析方法分析ERa基因多态性在ICP人群中的分布 规律以及ERa基因型、等位基因与ICP的相关关系。
结果 (1)E＆基因XbaI位点多态性在ICP组 和对照组的之间有统计学意义。(2)ERα基因PvuⅡ位点多态性在ICP组和对照组的比较中无统计学意义。(3)ICP组中，突变杂合子基因型Xx的oR值为3.429(95％CJ：1.509—7.791)，XX、Xx联合分析oR 值为3.143(95％CJ：1.431—6.905)ICP组和对照组ERQ XbaI等位基因频率比较发现X等位基因的相对 危险度是x等位基因的2.071倍。(4)PvuⅡ和XbaI联合基因型分布在ICP组和对照组问有统计学差 异，杂合子联合基因型Ppxx与野生型pp珏之间的差异在ICP组和对照组中有统计学意义，oR值为 3.956(95％CI：1.287—12.157)。
结论 ERa基因XbaI酶切位点限制性片段长度多态性与江西籍汉族 人群ICP的发生之间存在相关性。而PvuⅡ酶切位点限制性片段长度多态性与该病无关。X等位基因是ICP发病的易感基因，Xx基因型为易感基因型，单倍体PpXx可能使ICP发病风险升高。
【关键词】妊娠并发症；胆汁淤积症，肝内；受体，雌激素；多态性，限制性片断长度； 聚合酶链反应
妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种发生于妊娠中晚期特有的并发症，其病因学说众多，但确切的机制至今不明，内分泌、遗传、环境因素可能在其发生过程中起作用。有研究表明胆汁淤积状态可能是由于个体对血浆雌激素水平升高的遗传易感性所决定[1]。本研究通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术，检测ERa基因多态性在江西籍汉族ICP孕妇和非ICP正常孕妇之间的分布并分析是否有相关性，进而为探索 ICP的病因提供实验依据。 采用病例对照研究方法，选取2004年8月至 2005年3月在江西省妇幼保健院治疗的ICP孕妇 54名。纳入标准：1.符合ICP诊断标准；2.江西籍 汉族单胎妊娠妇女。ICP诊断标准根据参考文献 [2]。对照组选择54名在江西省妇幼保健院同期分娩的正常孕妇。为了确保遗传背景的同质性，该组 同样来源于江西籍汉族孕妇，无ICP临床症状。 ICP组和对照组均来自于研究期间在我院单胎妊娠分娩者。无病毒性肝炎征象(乙肝表面抗原阴性，无甲肝、丙肝抗体)，妊娠前无肝胆系统急慢性疾病。 除ICP组合并ICP外，两组均无其它妊娠合并症及并发症。经t检验，ICP组和对照组在年龄、孕产次上无统计学意义(P>0.05)。 1．样本采集：取受试者空腹2ml外周血样，滴于定性滤纸上制成2.0 cm×2.0cm的血斑，共采集 2张。一20℃冰箱冷冻保存，以供提取DNA。 3．ERa基因的扩增和检测：(1)PCR扩增：设计引物，使ERa基因上两个预研究的单核苷酸多态性位点在该引物的扩增区域内。上游引物： 5’-CCT CTG ATT TTC ACG CAG T()-3’下游引物：5’-ACC TGC ACC AGA ATA TGT TAC-3’ (上海生工合成)。反应总体系20 ul。10×Buffer 2ul，2.5 mM dNTP混合物1.68ul，Taq DNA酶 1 U，25 mM MgCl2 1.68ul，上、下游引物各 50 pmol，模板DNA 10～50 ng。循环参数：95℃预变性3 min，95℃ 1 min，64℃45 s，72℃45 s，共 30个循环，接72℃ 10 min，保温于4℃。(2)酶切及电泳：采用10 ul酶切反应体系。该体系包括PCR 产物4ul，限制性内切酶0.4 ul，Buffer G或Buffer Tango 1 ul(由Fermentas随酶供应)，灭菌双蒸水 4.6 ul。37℃水浴16 h。酶切扩增产物采用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(700V，1 h)检测。银染后观察结果并拍照纪录。鉴定酶切产物并判断其基因型。 PvuⅡ酶切后共出现三种基因型：PP型 (635 bp)，Pp型(635 bp，459 bp，176 bp)，pp型 (459 bp，176 bp)(图1)。Xba I酶切后出现三种基 因型：XX型(635 bp，)，Xx型(635 bp，504 bp，131 bp)，xx型(504 bp，131 bp)(图2)(基因型中的大写字母均表示存在点突变而使该酶切位点消失，小写字母表示存在该酶切位点)。 ![]()
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二、ERa Xba I基因型频率和等位基因频率的比较 ICP组孕妇ERa Xba I基因型XX、Xx、xx频率与对照组有统计学意义(z2=9.003，P=0.009)。 如果将野生型xx的oR值作为1，则突变杂合子基 因型Xx与野生型xx在两组间的比较有统计学意义(x2=8.947，P=0.003)，oR值为3.429(95％ CI:1.509-7.791)。突变纯合子基因型XX与野生型xx在两组问的比较无统计学意义(P=0.666), oR值为1.714(95％CI：0.317-9.275)。提示携带杂合子突变等位基因型的个体患ICP的危险性升高。由于本实验检出的XX基因型较少，将XX、Xx 基因型联合分析发现：oR值为3.143(95％CI: 1.431-6.905)，差异有统计学意义(X2-8.359，P= 0.004)(表1)。提示携带突变位点X的基因型个体患ICP的危险升高。 ICP组和对照组ERa Xba I突变的等位基因频 率分别为33.3(36/108))和19.4%(21/108)(X2=5.362，P=0.021)，oR=2.071(95％CI：1.112-3.859)。X等位基因的相对危险度是x等位基因的 2.071倍，提示X等位基因可能为ICP的为易感等位基因。 三、ERa PvuⅡ基因型频率和等位基因频率的比较ICP组孕妇ERa PvuⅡ基因型PP、Pp、pp频率 与对照组无统计学意义(z2-5.703，P=0.079)。 如果将pp的oR值作为1，突变杂合子基因型 (Pp)、突变纯合子基因型(PP)和PP+Pp与pp相比结果见表2。PP+Pp型和pp型的分布在ICP组 和对照组间无统计学意义(X2=0.044，P=0.835) (表2)。 ICP组和对照组ERαPvuⅡ突变的等位基因频率分别为39.8％(43/108)和49.1％(53/108)(X2= 1.875，P=0.171)。Xba I、PvuⅡ位点等位基因关联分析揭示了明显的连锁不平衡，并且由于两位点间仅相距50 bp， 将两个RFLP位点可以联合起来分析，理论上可组成9种单倍型。本实验未检出PpXX和ppXX两种基因型。其余7种联合基因型在ICP组和对照组 的总体分布有显著差异(X2=20.041，P=0.001)。 以野生型单倍体ppxx的0R值作为1，分别计算 6种联合基因型oR值。仅杂合子联合基因型 Ppxx与野生型ppxx之间差异统计学意义(X2=6.042，P=0.014)，oR=3.956(95％CI：1.287-12.157)；其余5种无统计学意义(表3)。 ![]()
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ERa是一个含有595个氨基酸的，分子量66kD的蛋白质。编码ERa的ERa基因在1986年被 Green等[4]成功克隆出，定位于人类染色体6q25.1， 全长299 637 bp，由8个外显子和7个内含子组成。 目前检测到的多态性位点均位于被称为活化因子1 的A/B区，该区对雌激素应答的启动子的刺激转录有着非常重要的作用。在外显子1上包含两种多态性，分别是位于密码子10上由C/T转变引起的 Msp I RFLP和位于密码子87上的由G/C转变引 起的BstU I RFLP。BstU I多态性可导致ER基 因第87号密码子突变，而87号密码子位于ER的转录活性区，可能会影响ER转录[5]。PvuⅡ和Xba I多态性位于内含子1中，分别是由距第二外显子上游0.4 kb处C/T转变引起的PvuⅡRFLP和距第二外显子上游0.35 kb处的A/G转变引起的 XbaI RFLP。酶切后可获得以下基因型：野生型纯合子PP(XX)缺乏酶切位点，Pp(Xx)为突变型杂合子，pp(xx)为突变型纯合子。由于两位点之间仅相距50 bp，这导致了它们共同作用在相关性研究中的可行性。ERa基因第1内含子含有增强子、启动子等重要的调节序列，因而在其中发生的变异有可能影响到ERa的表达和功能。因此不同的ERa基因型可能决定不同个体间ERa表达水平和功能的差异，进而影响到体内雌激素的生物学作用。 本研究结果显示ICP组和对照组的三种Xba I 基因型的分布有明显差异。ICP组中的Xx基因型明显高于对照组，而对照组中的xx基因型则明显高于ICP组，推测X等位基因可能与ICP的遗传易感性有关，具有突变位点基因型患ICP的风险可能升高。另外，两组孕妇ERαPvuⅡ等位基因频率和 基因型频率的比较无显著性差异。PP+Pp型和pp 型的分布在ICP组和对照组间无统计学意义。ICP 组和对照组ERα PvuⅡ突变的等位基因频率无统计学意义。ERα PvuⅡ多态性在江西籍汉族ICP患者的发病过中似乎不起主要作用，突变基因并没有增加ICP的发病风险。 本研究ERα PvuⅡ和Xba I基因型频率符合 Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明研究对象的选择是随机的，具有群体代表性，所有基因型均检测到。PvuⅡ和Xba I位点等位基因关联分析提示了明显的连锁不平衡，它们在ICP组和对照组中的多态位点等位基因之间都存在，且两者仅相距50 bp。 因此将这两个RFLP位点联合分析，以提高联合基因型共同作用的可能性。结果显示，ER基因型在 ICP中以PpXx最为常见，而在对照组孕妇中以 Ppxx、ppxx为多数。此外两组均未发现PpXX及 ppXX两种基因型，这与以往的一些有关ERa基因多态性的研究相似，即在日本和瑞典的女性中均未检测到以上两种基因型[6,7]。这说明在一条染色体 上pX型的单倍体很少出现。经统计分析，杂合子联合基因型PpXx与野生型ppxx之间差异显著，两位点单倍型分布有统计学意义，PpXx型发生ICP 的危险性是ppxx型的3.956倍，提示携带杂合子 PpXx基因型可能使ICP发病风险升高。 雌激素受体基因多态性与疾病的相关性研究日益增多，因为基因多态性的分布与种族及地域关系密切，故不同种族的人群ERa基因多态性与疾病的 相关性有所不同。但ERa基因多态性与ICP的相 关性研究目前却不多见。Eloranta等[83的研究指出 ERα 基因PvuⅡ和Xba I多态性在芬兰ICP妇女中 似乎不起显著作用，PvuⅡ和Xba I等位基因和基因型分布在ICP组和对照组之间是相当的，且联合基因型的分布也未能揭示统计学意义(P=0.612)， 这与我们的结果有较大的不同。由于芬兰是ICP 高发国家，遗传背景和我们有很大的差异，且种族问生活环境和生活习惯也不相同，这可能是导致不同人群对ICP存在易感性差别的原因。同时，即使同 一种族在不同的地域也会导致雌激素受体基因多态性，我们用x2检验比较江西籍妇女与我国其它地区 (成都)的Xba I基因型频率分布存在着明显的差异[9]，这种差异可能是由于地域差异引起的。因此 对ER基因多态性与ICP的相关关系仍需在不同地域、不同民族进行进一步的大样本研究验证，以便为对妊娠期肝内胆汁淤积症基因诊断和治疗基提供更加充分的证据。 ![]()
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