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我前几天分享了棕榈酰化的研究思路，小伙伴们反馈希望能多分享点这种新热点的研究思路，没问题，今天就给大家安排上琥珀酰化，咱们争取各种蛋白修饰都来一遍。

蛋白质琥珀酰化修饰 (succinylation)于2011年由芝加哥大学赵英明教授团队在Nature Chemical Biology发文首次报道，指的是琥珀酰基供体在琥珀酰辅酶 A的介导下将琥珀酰基团共价结合到赖氨酸残基的过程。它参与了许多核心能量代谢途径，影响线粒体中的代谢过程，因此在线粒体失调相关疾病的研究中具有重要价值。

今天带来的这篇文章正是将琥珀酰化与线粒体生物发生联系起来进行的研究。文章发现SUCLG1通过限制线粒体RNA聚合酶（POLRMT）的琥珀酰化，维持线粒体DNA转录、线粒体生物合成和白血病细胞增殖。跟我一起看看吧~ps：对蛋白修饰感兴趣的宝子可以联系我，思路设计或者生信分析有我无忧！

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题目：SUCLG1限制POLRMT琥珀酰化以促进线粒体生物发生和白血病进展

杂志：The EMBO Journal （IF 9.4）

发表时间：2024.6   

研究背景

线粒体是通过电子传递链（ETC）产生能量的细胞发电站。线粒体基因组（mtDNA）以区隔化的方式编码必需的ETC蛋白，然而，mtDNA功能代谢调节的机制尚不清楚。该研究报道了三羧酸循环酶琥珀酸-辅酶A连接酶SUCLG1的表达与各种TCGA癌症转录组中的ETC基因密切相关。

研究思路

研究结果

SUCLG1维持mtDNA编码的基因表达和线粒体质量

为了确定哪些代谢酶可能调节mtDNA功能，作者在TCGA转录组学研究中分析了线粒体代谢基因和ETC基因之间的相关性。SUCLG1与ETC基因在各种癌症中的表达密切相关。接下来研究SUCLG1是否作为有丝分裂发生的积极调节因子。CD34+脐带血（CB）细胞作为正常对照。消耗SUCLG1显著降低了测试细胞的mtDNA丰度和MTG（一种荧光染料）强度。此外，在结直肠癌（HCT116）、肺癌（A549）和肝癌（HepG2）的细胞系中，SUCLG1的缺失降低了线粒体质量。    

作者假设SUCLG1可能调节细胞器特异性的有丝分裂发生。AML细胞系（HL60和MV411）中SUCLG1的缺失降低了mtDNA编码基因的mRNA和蛋白表达。控制线粒体生物发生的核因子，包括PGC-1-α和NRF2显示出轻微的变化。这些结果表明SUCLG1维持mtDNA编码的基因表达。为了验证SUCLG1在线粒体发生中的作用，作者对MV411细胞的线粒体进行了电镜分析。SUCLG1敲低细胞的线粒体数量减少了约50%，而且显著下调了五种不同复合物的催化活性。这些数据共同支持SUCLG1维持有丝分裂发生。    

SUCLG1降低琥珀酰辅酶A水平，限制POLRMT琥珀酰化

接下来研究SUCLG1如何调节细胞器特异性生物发生。代谢组学分析表明，糖酵解中间体在SUCLG1敲低的MV411细胞中增加。琥珀酰辅酶a （SucCoA）在SUCLG1缺陷细胞中积累。代谢通量测定显示，SUCLG1敲低的细胞增加了基础糖酵解速率，表明糖酵解可能增强以补偿线粒体呼吸缺陷。MV411和HL60细胞中SUCLG1耗损后葡萄糖消耗和乳酸生成均升高。细胞ATP的定量证实了SUCLG1缺失的MV411和HL60细胞的能量供应减少。与葡萄糖摄取相反，在SUCLG1缺失的MV411细胞中，谷氨酰胺消耗轻度降低。因此，糖酵解在SUCLG1缺陷细胞中上调，以应对线粒体功能障碍并维持细胞存活。    

在SUCLG1敲低的细胞中，α-KG和琥珀酰辅酶a升高，同时ATP和GTP水平降低。重新表达野生型SUCLG1，而不是其催化缺陷突变体，恢复了琥珀酰辅酶a的丰度。SLC13A5是一种细胞膜结合转运蛋白，在敲除SUCLG1后表达增加。进一步分离线粒体以量化琥珀酰辅酶a，其变化模式与细胞琥珀酰辅酶a相似。因此，SUCLG1抑制线粒体琥珀酰辅酶a，这可能有助于其调节线粒体生物发生的作用。

为了确定SUCLG1的潜在靶点，分析了SUCLG1与mtDNA复制和转录调节因子之间的相互作用。在MV411细胞中，内源性SUCLG1容易与POLRMT和TFAM相关，但不与POLG相关。值得注意的是，在SUCLG1敲低的MV411和HL60细胞中，内源性POLRMT的琥珀酰化水平也上调。这些结果表明SUCLG1限制了POLRMT琥珀酰化。

接下来，从MV411细胞中免疫纯化HA标记的POLRMT和flag标记的SUCLG1，并用SUCLG1- flag蛋白预孵育反应缓冲液。体外琥珀酰化反应显示，SUCLG1-Flag酶抑制POLRMT琥珀酰化，而不是其热失活形式。总之，SUCLG1限制了琥珀酰辅酶a诱导的POLRMT琥珀酰化。此外，作者从MV411稳定细胞中免疫纯化了POLRMT。重新表达野生型SUCLG1，而不是其突变体，恢复了内源性POLRMT的赖氨酸琥珀酰化。综上所述，SUCLG1限制琥珀酰辅酶a水平下调POLRMT琥珀酰化。

为了测试SUCLG1和POLRMT之间的功能相关性，分别用丙酮酸和尿苷处理SUCLG1缺失的MV411细胞，这两种物质分别支持线粒体呼吸和RNA合成。补充尿苷，而不是丙酮酸，部分地挽救了suclg1缺失细胞的线粒体呼吸缺陷和细胞增殖。丙酮酸和尿苷联合治疗没有进一步增加耗氧量和细胞生长。这些观察结果表明，缺乏SUCLG1的细胞对尿苷具有营养缺陷。SUCLG1可能参与调节线粒体转录。    

K622琥珀酰化抑制POLRMT活性

接下来作者研究了POLRMT琥珀酰化的生化作用。先前的蛋白质组学分析表明，POLRMT的赖氨酸622 （K622）是一个进化上保守的残基，可能被琥珀酰化。K622位于POLRMT的DNA结合槽。    

接着进行了线粒体基因组免疫沉淀（MitoChIP）测定，以确定POLRMT和mtDNA之间的相互作用。野生型POLRMT及其K622R突变体与mtDNA显著相互作用。模拟琥珀酰化状态的POLRMT^K622E显示与mtDNA的结合受损。重要的是，野生型POLRMT的mtDNA结合在suclg1敲除的细胞中减少，而K622突变体则没有。接下来，用放射性标记的UTP进行细胞器转录试验，直接监测POLRMT的活性。与野生型POLRMT相比，K622E突变体不足以维持从稳定的MV411细胞分离的线粒体中的UTP放射性标记。POLRMTK622R突变体将线粒体转录恢复到与野生型POLRMT相似的水平，支持K622琥珀酰化在线粒体转录中的调节作用。在POLRMTWT拯救的细胞中，SUCLG1的缺失强烈降低了线粒体转录，但在K622E突变体拯救的细胞中，这种程度较低。与此一致的是，沉默SUCLG1有效地降低了重新表达POLRMTWT的细胞中的mtDNA丰度、mtDNA编码的基因表达和耗氧量，但在K622突变体拯救的细胞中，这一程度较低。这些结果共同表明，SUCLG1抑制POLRMT的K622琥珀酰化以维持线粒体转录。

为了明确SUCLG1不同作用之间的关系，作者敲低了OGDH以降低MV411细胞中琥珀酰辅酶a的水平。OGDH的缺失降低了POLRMT的K622琥珀酰化，DMS处理对其影响最小。然而，消耗OGDH会轻微改变mtDNA编码的基因表达和线粒体质量。有趣的是，OGDH敲除后，线粒体呼吸减少。补充DMS对对照细胞的mtdna编码基因表达、线粒体质量和呼吸没有显著影响，但显著增强了OGDH敲低细胞的丝分裂发生和呼吸。

随后，作者研究了POLRMT琥珀酰化和线粒体翻译之间的潜在联系。MRPL45是线粒体核糖体中决定蛋白质翻译活性的关键因子。癌细胞系百科全书转录组显示，SUCLG1表达与MRPL45呈显著正相关。采用MRPL45^low （Hs578T和HCC1806）和MRPL45^high （KM12和A549）细胞系进行进一步分析。核苷酸定量分析显示，MRPL45high细胞系具有更高水平的ATP和GTP，并伴随着POLRMT K622琥珀酰化的降低。POLRMT琥珀酰化与能量产生之间的联系可能将线粒体转录和翻译结合起来，以确保mtDNA编码蛋白的有效产生。    

白血病衍生的FLT3突变体上调SUCLG1以促进有丝分裂发生

AML（急性髓系白血病）是一种基因异质性的恶性肿瘤，有丝分裂发生增强，导致其依赖线粒体呼吸。为了确定在AML中重塑有丝分裂发生的遗传因素，在一组AML细胞系中测试了POLRMT琥珀酰化。在AML细胞系中，SUCLG1蛋白表达与K622琥珀酰化呈负相关。进一步从测试的细胞系中提取代谢物，并定量细胞琥珀酰辅酶a，其倾向于与POLRMT琥珀酰化呈正相关。FLT3是一种膜结合酪氨酸激酶，在约30%的AML患者中发生突变。与其他AML细胞系和健康对照相比，FLT3突变细胞中的K622琥珀酰化水平较低。这些结果表明FLT3可能重塑AML细胞的有丝分裂发生。

为了测试FLT3是否调节有丝分裂发生，我们将HA标记的FLT3及其突变体过表达到CD34+ CB细胞中。FLT3TKD和FLT3ITD突变体增强了SUCLG1的表达，降低了琥珀酰辅酶a的水平，而野生型激酶没有。与此一致的是，过表达FLT3突变体降低了POLRMT琥珀酰化。mtDNA丰度、mtDNA编码基因表达、线粒体质量和细胞呼吸同时增加。进一步在稳定的CD34+ CB细胞中去除SUCLG1并测试线粒体呼吸。FLT3ITD以SUCLG1依赖的方式显著增加氧气消耗和呼吸复合物活性。

接下来，在人白血病细胞中测试了FLT3对SUCLG1的调控。遗传或化学抑制FLT3可降低MV411和MOLM14细胞中SUCLG1的表达，增加琥珀酰辅酶a水平和免疫纯化的POLRMT的K622琥珀酰化。更重要的是，在FLT3敲除的MV411细胞中，mtDNA丰度、mtDNA编码基因表达和线粒体质量下降。FLT3信号可能对不同的呼吸复合物具有特异性，因为在FLT3敲除的细胞中复合物IV活性没有显著改变。然而，这些数据共同表明，突变型FLT3上调SUCLG1介导POLRMT低琥珀酰化并促进有丝分裂发生。    

FLT3信号调节核转录增强线粒体呼吸

FLT3对白血病转录组的影响先前已在MOLM14和MV411细胞中进行了分析。作者收集了差异表达的线粒体基因，其中25个基因在FLT3耗尽后在两种细胞系中下调。作者证实，在FLT3敲除的MV411细胞中，这些基因的mRNA表达减少。作为阴性对照的柠檬酸合成酶（CS）的mRNA表达在FLT3敲低的细胞中没有显著改变。对这些基因潜在启动子区域的分析揭示了至少三种不同的共识序列，这可能允许转录调节因子在响应FLT3信号时共同调节它们的表达。    

以SUCLG1为重点，作者开始定义FLT3对其转录的调控。针对已知的转录调控因子（每种3个shRNA）建立了一个shRNA文库，并将它们转导到MV411细胞中。消耗E2F1，而不是其他转录因子，强烈抑制SUCLG1的表达。用FLT3抑制剂处理E2F1敲低的细胞没有进一步提高POLRMT琥珀酰化。接下来，检测了E2F1与SUCLG1基因的结合。SUCLG1转录起始位点（TSS）周围的基因组DNA序列包含至少两个不同的E2F1结合基序。用E2F1特异性抗体进行ChIP-qPCR检测。在MV411和MOLM14细胞中都可以很容易地检测到E2F1在SUCLG1基因上的占用。在E2F1敲低的细胞中，SUCLG1与E2F1的结合被强烈削弱，支持ChIP抗体的特异性。更重要的是，E2F1的缺失抑制了MV411的细胞呼吸。使用FLT3抑制剂治疗并没有进一步降低E2F1敲低细胞的耗氧量。总的来说，FLT3信号调节核转录程序以增强线粒体呼吸。    

SUCLG1抑制POLRMT琥珀酰化以支持白血病增殖

考虑到线粒体呼吸对于白血病的生长是不可或缺的（Egan et al, 2021），作者研究了POLRMT琥珀酰化在白血病细胞中的病理生理功能。在MV411细胞中敲除SUCLG1，观察到细胞增殖明显受到抑制。重新表达SUCLG1^WT，而不是其催化突变体，恢复细胞生长。用POLRMT特异性抑制剂处理能显著降低SUCLG1^WT拯救的细胞中的细胞增殖和集落形成，但不能进一步降低重新表达SUCLG1突变体的细胞的增殖。重新表达POLRMT^K622R，而不是POLRMT^K622E，可以恢复细胞增殖。SUCLG1的缺失抑制了POLRMT^WT拯救的细胞的增殖，但对POLRMT^K622E拯救的细胞没有抑制作用。值得注意的是，在重新表达POLRMT^K622R的细胞中，SUCLG1的缺失也显示出生长抑制作用，这表明在白血病背景下，SUCLG1和POLRMT之间的关系不是线性的。SUCLG1可能具有调节POLRMT琥珀酰化以外的功能来支持白血病细胞增殖。    

作者假设增强的有丝分裂发生可能使FLT3突变细胞依赖于氧化磷酸化。正如预期的那样，在细胞存活试验中，携带FLT3突变的细胞系对鱼藤酮（ETC复合物I抑制剂）的敏感性增加。此外，过表达FLT3ITD可提高CD34+ CB细胞对鱼藤酮的敏感性。

接下来，在体内测试了白血病的发展。HA标记的FLT3^ITD与MLL-AF9共转导进入小鼠骨髓细胞，建立小鼠白血病。此外，针对Suclg1或Polrmt的shRNA在白血病骨髓细胞中稳定表达。将稳定的骨髓细胞移植到亚致死照射受体。消耗sucl1或Polrmt均可显著延长动物存活时间。与培养细胞系的结果一致，suclg1敲低组在POLRMTK622R突变环境下具有中等存活率。这一观察结果还表明，SUCLG1酶活性或琥珀酰化可能存在影响白血病发展的其他功能。总之，SUCLG1和POLRMT对于突变型flt3驱动的白血病至关重要。

接下来，将稳定的MV411细胞移植到亚致死辐照的NSG小鼠体内，建立人源化白血病模型。在POLRMT敲低的细胞中重新引入野生型POLRMT或POLRMT^K622R，将白血病的进展恢复到类似的水平。在重新表达POLRMT^WT的MV411细胞中，耗尽SUCLG1可显著延缓白血病的发展，而在用POLRMT^K622R突变体建立的白血病模型中，观察到较温和的抑制作用。    

为了确定POLRMT琥珀酰化的病理相关性，收集了人类正常和白血病骨髓样本并对其进行测序以确定FLT3突变状态。代谢物定量显示，与健康对照组相比，FLT3WT和FLT3TKD/ITD AML样本中的琥珀酰辅酶a水平均有所降低。在FLT3突变的AML中，K622琥珀酰化显著降低，而POLRMT蛋白表达无明显变化。与此结果一致，SUCLG1蛋白在FLT3突变的AML样本中过表达。在TCGA AML数据集中进一步研究了SUCLG1与白血病发展之间的关系。在携带FLT3突变体的患者中，SUCLG1的mRNA水平显著升高，而POLRMT没有升高。在FLT3WT患者中，高表达的SUCLG1与较差的总生存期有关，但在FLT3TKD/ITD个体中则不然。这一观察结果还表明，FLT3和SUCLG1可能存在调节线粒体生物发生和促进白血病发展的其他功能。综上所述，SUCLG1通过抑制琥珀酰辅酶a水平来限制POLRMT琥珀酰化并增强线粒体活性。突变的FLT3调节核转录程序，上调SUCLG1表达和线粒体基因，导致有丝分裂重塑和AML进展。    

文章亮点

1）SUCLG1降低琥珀酰辅酶a水平以限制POLRMT琥珀酰化。

2）K622琥珀酰化抑制POLRMT活性。

3）FLT3突变调节SUCLG1激活POLRMT。    

4）突变体FLT3改变核转录以重塑线粒体生物发生。

5）在小鼠和人源化模型中，POLRMT或SUCLG1基因缺失可延缓白血病进展。

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