欢迎来看雪球的生信套路！咱们继续来看看，CNS在2025年第一个月都发布了哪些包含生信的震撼新作，又能怎样为咱们的课题研究助力。
今天介绍的这篇文献，题目短小精悍——GZMK-expressing CD8+ T cells promote recurrent airway inflammatory diseases , 《表达GZMK的CD8+T细胞促进复发性气道炎症性疾病》，短短一句话却包含了两处颠覆固有认知的发现，听雪球慢慢讲明：
一般认为，过敏是由CD4+T淋巴细胞介导的II型炎症引起，但长期存在于息肉组织的细胞却主要是记忆性CD8+T细胞，其中，具有KLRG1+CD27+表型的CD8+ T细胞会随鼻息肉疾病严重程度增加而明显增多。研究者还发现，患者外周血中也有CD8+ T细胞与组织中的KLRG1+CD27+ T细胞属于同一克隆，提示这些记忆细胞可能不断地从外周被招募到黏膜组织，促进局部炎症反应导致息肉形成。
那么，这些CD8+T细胞也具有II型炎症的相关特点吗？比如，表达II型炎症细胞因子，或者表达经典细胞杀伤作用所需的颗粒酶B（GZMB）？答案是都没有，而是高表达颗粒酶K（GZMK）。并且，GZMK的组织含量与疾病严重程度正相关，研究结果证明，GZMK可以作为生物标志物预测鼻息肉复发或合并哮喘，效果优于临床常用的传统标记物，如组织嗜酸性粒细胞、IL-5。
GZMK的作用机理，也突破了长久以来的免疫学概念——抗体是可以特异识别病原体并激活补体的唯一方式。研究团队的工作将GZMK定义为一种新的补体级联激活蛋白酶，提示了一种通过T细胞来激活补体的全新途径，为获得性免疫机制和补体激活建立了第二条链接。在肿瘤和许多自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、狼疮性肾炎）疾病组织中发现的表达GZMK的CD8+T细胞在疾病病理学中的功能重要性尚未确定，有待在日后的研究中继续探索。
这项革新性发现中，确定复发性鼻息肉（NP）中持续存在的T细胞克隆 - 与NP复发相关的CD8+ T细胞亚群 - 组织GZMK水平可预测NP复发和哮喘合并症这重要的三步，都是通过生信技术完成分析的！
这篇文章总体而言，实现了临床问题-基础研究-临床应用的闭环。为了达成闭环和实现Nature级别的发表，包含大量湿实验和动物模型验证。雪球仅介绍生信分析部分，如果各位同学正面临申请基金、毕业大论文等需要补实验的情况，也可以添加雪球，详细聊聊，让雪球帮你的课题把把关！
技术路线
患者招募与样本收集：
从北京同仁医院耳鼻喉科和过敏科招募了206名（2011-2024）接受鼻部手术的患者，包括172名慢性鼻窦炎伴鼻息肉（NP）患者和34名鼻中隔偏曲患者（作为本研究中的健康对照组）。
排除了患有免疫缺陷、怀孕、无鼻息肉的慢性鼻窦炎、变应性真菌性鼻窦炎、囊性纤维化或手术前4周内服用过口服皮质类固醇的患者。
scRNA-seq和scTCR-seq：
使用10X Genomics平台对人类组织和外周血样本以及小鼠BALF细胞进行单细胞测序。
激光捕获显微解剖与bulk RNA-seq分析：
对GZMK+细胞聚集的组织区域进行激光捕获显微解剖，并使用Smart-seq2协议进行bulk RNA测序。
scRNA-seq数据分析：
使用CellRanger和Seurat软件对scRNA-seq数据进行处理，包括数据整合、降维、聚类和差异表达分析。
TCR库分析：
对bulk TCR测序数据使用Cutadapt和TRUST4进行序列组装，对sc TCR-seq数据使用CellRanger进行组装，并使用lgblast进行TCR序列注释。
统计分析：
使用Prism v.9 进行人类数据的统计分析，
使用 R v.4.3.3 和相应的软件包进行小鼠数据分析和多项线性回归分析。
转录组公共数据下载分析
要注意人源还是鼠源哦。
实验结果
确定复发性NP中持续存在的T细胞克隆
Fig 1
Extended Data Fig 1
Extender Data Fig 2
和预期一致，T 细胞库在个体之间是不同的，1,585 个 TCRα 中只有 5 个和 1 个 TCRβ 链中只有 3,888 个在不同患者之间共享。相反，始终在同一患者身上的两次手术中获得的 NP 组织中鉴定出共同的 TCRα 和 TCRβ 链（Fig 1c），表明相同克隆谱系的细胞在疾病复发期间重定位了 NP 组织。此外，一些持续存在的克隆在两个手术样本中都是最显性的克隆之一（Fig 1c），表明局部增殖和扩张。
将3名在研究时接受了第二次手术的NP复发患者（NP1-NP13）两次NP活检的TCR序列进行比较，以识别T细胞的常见克隆。共有42,466个免疫细胞被纳入分析，根据其转录组进行聚类，通过各自的特征基因表达鉴定淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和肥大细胞的亚群（Extended Data Fig 1a,b）。携带功能受体的T细胞可以在HC和NP组织中聚集成不同的亚群（Fig 1d,e,Extended Data Fig 1d,e）。
在患者NP11-NP13中鉴定到的共享克隆，大多数被定位到T0和T1，即两个CD8+T细胞亚群，而非CD4+T细胞（Fig 1f,g and 2a）。三位患者的两次手术至少相隔7个月，因此推测NP复发可能伴随着先前疾病发作中已经存在的CD8+T细胞克隆的组织定位，且这些CD8+T细胞可能是疾病相关的记忆CD8+T细胞。为简单起见，将这些共享克隆称为持久性克隆。
与NP复发相关的CD8+T细胞亚群
Fig 2
T0 细胞显示出常规的驻留记忆 T （TRM） 细胞表型，表达组织驻留所必需的基因，例如 ITGAE、CD69、PRDM1、ZNF683 和 RUNX3。T1 亚群包含相对较少的 TRM 细胞，但包含许多表达效应记忆 T 细胞 （TEM） 标志物，包括 KLRG1 和 CD27（Fig 2a and Extended Data Fig 1e）。持久性克隆主要是TRM和TEM样细胞。
进行细胞相对丰度研究时，按疾病严重程度对NP组织进行分层，发现ITGAE+KLRG1+CD27+ 细胞，随着疾病的严重程度而逐渐增加，在 svNP（复发性NP或合并哮喘，定义为严重NP） 中比在 NP 中更丰富（Fig 2b-c）。
患者NP11和NP13外周血CD8+T细胞显示出非常相似的细胞聚集的一般模式。根据亚群与T1细胞的相似性，团队进一步推测来自T细胞记忆库的持久克隆可以持续部署到组织中，从而可能促进疾病病理和复发。
组织GZMK水平可预测NP复发和哮喘合并症
Fig 3
2型细胞因子促进气道中的嗜酸性粒细胞募集、组织重塑和B细胞活化，是慢性鼻窦炎和哮喘组织病理学最公认的驱动因素。然而，T1细胞几乎不表达2型细胞因子的mRNA（Fig 3a）。而CD8+T细胞表达的重要效应分子——颗粒酶，其中颗粒酶K（GZMK）则被发现在T1细胞中独特高水平表达（Fig 3b）。除T细胞外，GZMK还由一小部分NK细胞表达（Extended Data Fig 1b,d and Fig 3c），这些细胞在svNP患者中显著增加（Extended Data Fig 2e,f and Fig 3c)。
为了探索GZMK在NP发病机制中的潜在作用，分析148名患者（21名HC、62名NP和65名svNP）的鼻组织，发现组织而非血清GZMK蛋白水平在NP中升高，在svNP中进一步升高（Fig 3d）。ROC结果显示，组织GZMK水平是比组织性嗜酸性粒细胞和IL-5水平更好的预测svNP生物标志物（Fig 3e）。综上所述，这些数据支持T1 KLRG1+CD27+CD8+细胞可能通过效应酶 GZMK 加剧气道炎症并促进气道疾病复发的可能性。
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