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今天再为大家介绍下可以在科研界大杀四方的“国自然宠儿”，南京中医药大学就凭借此秒杀12+top期刊——HEPATOLOGY。也顺便给大家介绍下这本期刊吧：

ISSN：0270-9139

E-ISSN：1527-3350

出版社：John Wiley and Sons Ltd

影响因子：12.9

期刊简介和收稿范围：HEPATOLOGY是肝病领域的首要出版物，发表有关肝脏结构，功能和疾病各个方面的原创同行评审文章。每个月，杰出的编辑委员会都会监测和选择有关免疫学、慢性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、遗传和代谢性肝病及其并发症、肝癌和药物代谢等主题的最佳文章。

糖酵解作为细胞能量转换的关键步骤，一直是国家自然科学基金研究的热门领域。接下来我就带大家这篇糖酵解相关文章吧，该研究结合了RNA测序、蛋白质组学和代谢组学的方法来全面分析Wnt信号激活对HSCs代谢的影响，提供了从基因表达到蛋白质功能和代谢物变化的多层次数据。全文逻辑清晰、思路流畅，是一篇值得学习的好文章。PS：精巧的研究角度有时候比闷着头的研究更能解决问题！提高自己技能水平的同时，也不要忘了武装自己的头脑哦，如果你一时间想不出让人拍案叫绝的研究切入点，又急需高质量的发文，那就赶紧扫码联系我吧！（现在还有代金券可领取哦~）

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题目：经典Wnt信号通过LDH-A/HIF-1α转录复合物促进肝星状细胞糖酵解和肝纤维化

杂志：Hepatology

影响因子：IF=12.9

发表时间：2024年3月

研究背景

肝脏纤维化是一种以慢性肝损伤和细胞外基质积累为特征的病理过程。如果没有得到有效治疗，可能会发展为肝硬化、肝细胞癌或肝功能衰竭。因此，了解其发病机制对于开发治疗策略至关重要。肝星状细胞（HSCs）是肝脏中主要的促纤维化细胞，研究表明，在HSC活化过程中会发生快速的代谢重编程，特别是有氧糖酵解的增加。乳酸脱氢酶A（LDH-A）是糖酵解途径中的关键酶，其高表达或活性允许快速的糖酵解通量；HIF-1α作为低氧诱导因子，在糖酵解基因的转录激活中起着核心作用；Wnt信号通路在肝脏病理生理学中扮演着关键角色。本研究旨在探索Wnt信号如何通过LDH-A和HIF-1α调控HSC的糖酵解和肝脏纤维化。

研究思路

文献拆解

研究目的：探究canonical Wnt信号通路如何通过调节肝星状细胞（HSCs）的糖酵解过程来促进肝脏纤维化，并评估靶向LDH-A/HIF-1α复合体对治疗肝脏纤维化的潜力。

研究方法：

Ø使用HSC-LX2细胞系和小鼠原代HSCs来研究Wnt/β-catenin信号通路对糖酵解的影响； 

Ø通过RNA测序分析Wnt3a处理的HSCs中糖酵解相关基因的表达变化；

Ø利用双荧光素酶报告基因分析、共免疫沉淀（Co-IP）、电泳迁移率变化分析（EMSA）等技术研究LDH-A与HIF-1α之间的相互作用及其对糖酵解基因转录的影响；

Ø在小鼠模型中通过尾静脉注射维生素A-脂质体介导的siRNA或过表达质粒来特异性地调节HSCs中的LDH-A表达。

主要发现：

ØWnt3a能够增强HSCs的糖酵解活性，而β-catenin抑制剂或LDH-A siRNA能够降低这种活性；

ØLDH-A与HIF-1α直接相互作用，形成转录复合体，增强HIF-1α的稳定性，从而提高糖酵解基因的转录激活；

ØLDH-A的核转位依赖于importin β2，且在Wnt信号激活下发生；

ØLDH-A在HSC活化和肝脏纤维化中起着关键作用，LDH-A的抑制能够减轻小鼠肝脏纤维化。

结论：Canonical Wnt信号通过LDH-A/HIF-1α转录复合体促进HSCs的糖酵解和肝脏纤维化，为开发新的治疗肝脏纤维化的方法提供了科学依据。

研究主要结果展示

1.TCF4依赖的LDH-A转录激活有助于经典Wnt增强HSC中的有氧糖酵解

(A)用Wnt3a (100 ng/mL)处理24小时的LX2细胞的RNA-seq分析。热图显示差异基因，然后进行GO和KEGG富集分析；

(B)用Wnt3a (100 ng/mL)/β-catenin抑制剂XAV (10 μM)处理或用β-catenin siRNA转染24小时的LX2细胞中糖酵解基因mRNA表达的RT-PCR分析；

(C)使用LC-HRMS对用Wnt3a (100 ng/mL)/XAV (10 μM)处理或用β-catenin siRNA转染24小时的LX2细胞进行¹³C标记葡萄糖代谢通量分析，对糖酵解和三羧酸循环中显著变化的代谢物进行了量化；

(D)用Wnt3a (100 ng/mL)处理指定时间的LX2细胞中糖酵解基因mRNA表达的RT-PCR分析；

(E)用Wnt3a (100 ng/mL)/XAV (10 μM)处理或用β-catenin siRNA转染24小时的LX2细胞中LDH-A启动子活性的双荧光素酶报告基因检测；

(F-H)LX2细胞用Wnt3a (100 ng/mL)处理，或用靶向TCF1、TCF2和TCF3的siRNA转染24小时。通过双荧光素酶报告基因检测评估LDH-A启动子活性(F)，通过实时PCR检测LDH-A的mRNA表达(G)，通过定量蛋白质印迹分析检测LDH-A蛋白表达(H)；

(I)调控机制说明；

(J)利用JASPAR数据库预测了LDH-A启动子上TCF4可能结合的三个位点，并分别构建了它们的突变荧光素酶报告质粒。

2.经典Wnt信号特异性刺激HSC中importin β2依赖的LDH-A核转位

(A)使用经典核定位信号映射器预测的LDH-A的NLS的结构信息；

(B)使用Wnt3a (100 ng/mL)/XAV (10 μM)处理或用β-catenin siRNA转染24小时的LX2细胞，对LDH-A的核丰度进行蛋白质印迹分析并定量；

(C)使用Wnt3a (100 ng/mL)/XAV (10 μM)处理或用β-catenin siRNA转染24小时的LX2细胞，对LDH-A核定位进行免疫荧光分析并定量（细胞核用DAPI染色）；

(D)使用TGF-β(20 ng/mL)、PDGF-BB (20 ng/mL)或Wnt3a (100 ng/mL)处理24小时的LX2细胞，通过蛋白质印迹分析并定量importinβ1和importinβ2的蛋白质表达；

(E)使用Wnt3a (100 ng/mL)/importinβ抑制剂importazole (IMP, 10 μM)处理24小时的LX2细胞，通过蛋白质印迹分析并定量LDH-A的核丰度；

(F)用Wnt3a (100 ng/mL)处理LX2细胞24小时后，对LDH-A和importinβ2之间的相互作用进行Co-IP分析；

(G)使用经典核定位信号映射器预测LDH-A NLS上importin β2结合的两个可能位点，并进行单突变或双突变，从而构建3个LDH-A NLS突变质粒。用Wnt3a (100 ng/mL)处理/LDH-A NLS突变质粒转染24小时的LX2细胞中LDH-A核定位的免疫荧光分析和定量分析（细胞核用DAPI染色）；

(H)使用蛋白质印迹法分析用Wnt3a（100 ng/mL）处理/LDH-A NLS突变质粒转染24小时的LX2细胞中LDH-A的核丰度并进行定量分析；

(I)调节机制图示。

3.LDH-A与HIF-1α直接相互作用可稳定HIF-1α蛋白并促进HSC中糖酵解基因的转录激活 

(A-C)用Wnt3a（100 ng/mL）处理LX2细胞24小时。实时PCR分析HIF-1α的mRNA表达(A)，Western blot分析WCL(B)和核裂解物(C)中HIF-1α蛋白丰度并进行定量分析；

(D)EMSA用于确定用Wnt3a（100 ng/mL）处理24小时的LX2细胞中HIF-1α与HK2和PFK1的DNA序列的结合；

(E)用Wnt3a (100 ng/mL)处理LX2细胞24小时后，对LDH-A和HIF-1α的核共定位进行免疫荧光分（细胞核用DAPI染色）；

(F)用Wnt3a (100 ng/mL)处理LX2细胞24小时后，对LDH-A和HIF-1α之间的相互作用进行Co-IP分析；

(G)用GST pull-down分析转染GST-HIF-1α和His-LDH-A的HEK-293T细胞中的LDH-A和HIF-1α之间的相互作用，然后用Wnt3a（100 ng/mL）处理24小时；

(H)用LDH-A siRNA或LDH-A OE质粒转染24小时的LX2细胞中的HIF-1α蛋白降解情况，然后用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(10 μM)处理指定时间；

(I)使用Wnt3a（100 ng/mL）/蛋白酶体抑制剂MG132（10 μM）或LDH-A抑制剂FX-11（10 μM）处理或用LDH-A siRNA转染24小时的LX2细胞，对HIF-1α蛋白丰度进行蛋白质印迹分析并定量；

(J)使用MG132（10 μM）/Wnt3a（100 ng/mL）或FX-11（10 μM）处理或用LDH-A siRNA转染24小时的LX2细胞，对羟基-HIF-1α蛋白丰度进行蛋白质印迹分析并定量；

（K）调节机制的说明。

4.LDH-A利用其Gly28残基与HIF-1α相互作用，这对于HIF-1α稳定和HSC中糖酵解基因的转录激活必不可少

(A)在转染了HA标记的HIF-1α质粒和Flag标记的LDH-A质粒的N端(LDH-AN)、C端(LDH-AC)和全长(LDH-A-FL)的HEK-293T细胞中，Co-IP分析HIF-1α和LDH-A之间的相互作用；

(B)使用Discovery Studios 2019的ZDOCK模块对HIF-1α/LDH-A复合物进行分子对接和动力学模拟。将HIF-1α的肽段Leu557-Leu574对接至LDH-A蛋白质结构，并显示了直接相互作用残基；

(C)通过将LDH-A的所有氨基酸残基单独突变为丙氨酸进行虚拟丙氨酸扫描，计算突变能量来指示LDH-A与HIF-1α的结合能力；

(D)Gly28至丙氨酸突变体LDH-A与HIF-1α片段Leu557-Leu574相互作用的空间构象图示，显示LDH-A的Ala28残基与HIF-1α片段的Asp569和Asp570残基之间存在空间冲突；

(E)使用LDH-A野生型质粒或LDH-A Gly28突变质粒转染LX2细胞24小时，然后用环己酰亚胺(10 μM)处理指定时间，通过蛋白质印迹分析HIF-1α蛋白降解情况并进行定量分析；

(F-G)LX2细胞转染LDH-A野生型质粒或LDH-A Gly28突变质粒24小时。蛋白质印迹分析HIF-1α的核丰度并定量(F)，免疫荧光分析HIF-1α核转位并定量（细胞核用DAPI染色）(G)。

5.肝脏特异性LDH-A缺乏可减轻肝纤维化并抑制HSC糖酵解

(A)实验方案；

(B)使用HE染色、Masson染色和天狼星红染色进行免疫组化，并进行Ishak分期评分和阳性染色面积量化；

(C)测量肝脏羟脯氨酸含量；

(D)免疫荧光分析肝组织中LDH-A、HIF-1α、importin β2和α-SMA的表达和定位（细胞核用DAPI染色）；

(E-I)分离小鼠原代HSC进行分子检测。Western blot分析LDH-A和HIF-1α的核丰度并进行定量分析(E)，实时PCR分析HK2和PFK1的mRNA表达(F)，Western blot分析HK2和PFK1的蛋白质表达并进行定量分析(G)，测量细胞内乳酸水平(H)和细胞内ATP水平(I)。

文章小结

这篇文章揭示了乳酸脱氢酶A（LDH-A）与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）之间的直接相互作用，并形成了一个转录复合体，为理解HSC激活和肝脏纤维化提供了新的视角；通过细胞实验、动物模型和临床样本分析，提供了Wnt信号通路在肝脏纤维化中作用的新见解，并为未来的治疗干预提供了潜在的靶点。这么赞的文章，还不点个“赞+在看”，细细品味？另外我也可以像该研究一样，提供严谨的课题思路设计，为你的毕业/晋升之路保驾护航！有需要的来戳我吧！敲重点！！！近期有戳我领代金券活动哦，至高2000元，无论是课题设计、标书设计还是分析定制都可用哦！！！面面俱到，只等你来~