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哈喽小伙伴们，今天给大家带来的是自噬与STING1的相关研究。关注我的宝子对cGAS-STING信号通路都不陌生，屡次登上CNS，cGAS-STING信号通路是天然免疫系统中识别和响应细胞质DNA的关键途径。免疫可是和各种疾病都脱不了干系，所以这个通路想不火都难。
今天这篇来自中山大学团队的文章综合运用多种实验技术和方法研究了STING1如何通过非经典自噬抑制HSV-1病毒。这篇文章更侧重机制研究，用到的一些不太常见的实验方法，比如DQ-BSA Red降解实验，蛋白酶保护实验，长寿命蛋白降解实验等小伙伴们也可以学习一下，或许能用到自己的研究中。想从自噬或者STING通路角度设计课题的小伙伴可以联系我，我这里有专业团队1V1服务，课题设计、生信分析、国自然指导这里统统都有哦!
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题目：非典型自噬是通过激活STING1抑制HSV-1的新策略
研究背景
先天免疫是保护宿主细胞免受微生物病原体入侵的第一道防线，它可以发挥广泛的抗病毒反应并释放促炎信号。STING1可以通过上游激酶CGAS启动对病原体感染引入的外源DNA或宿主异常释放的内源DNA的识别，因此，STING1介导的先天免疫构成了机体抵御病原体威胁的外部防御。研究发现STING1可以通过诱导I型干扰素、炎症因子和巨噬/自噬的产生，在病毒抑制的免疫应答中发挥重要作用，但是其中的分子机制尚不明确。
研究结果
激活STING1可以诱导自噬
在HeLa和HEK-293A细胞中，瞬时转染HA-STING1质粒后，细胞自噬水平LC3-II指数均显著升高。在STING1过表达或STING1 cGAMP特异性激动剂联合使用后，溶酶体抑制剂CQ积累的LC3-II水平进一步升高。p-TBK1水平升高表明STING1确实被激活。此外，构建了包含全长STING1 （STING1[FL]）、缺乏免疫功能段（STING1[1-340]）的N-末端结构域1-340、面向细胞质功能区（STING1[CTD]）的C-末端结构域（149-379）和四个跨膜结构域（STING1[1-149]）的质粒。发现cGAMP或DNA病毒HSV-1激活STING1后，可以进一步诱导表达STING1 C端结构域片段的DLD1细胞LC3-II，表明一旦含有CTD功能域，就可以有效诱导自噬。同样，应用GFP-RFP-LC3发现，与典型的自噬诱导剂torin1一样，表现出显著的自噬诱导活性。
STING1[FL]、STING1[1-340]和STING1[1-149]能够定位于内质网和线粒体上是因为它们都含有4个跨膜结构域，而没有4个跨膜结构域的STING1[CTD]则分散在细胞质中。这些数据表明，激活STING1可以诱导自噬，但其四层跨膜结构域[1-149]不能诱导自噬。
激活STING1也可以诱导NCA（非经典自噬）
作为一种典型的自噬诱导剂，torin1在RB1CC1/FIP200-、ATG13-和ATG9A缺陷细胞中不能诱导自噬。与众所周知的NCA的化学诱导剂AMDE-1类似，通过基因过表达激活STING1可以增加上述细胞中LC3-II的水平。在由STING1[FL]和STING1[1-340]诱导的NCA过程中，典型自噬的底物SQSTM1/p62没有降解。此外，没有免疫功能的STING1[1-340]也能显著诱导NCA的产生，这表明虽然STING1是一种免疫分子，但STING1诱导的NCA不属于LAP。相反，在atg5−/−MEF细胞中，STING1不能诱导LC3-II。作为STING1的特异性激动剂cGAMP也能显著激活内源性STING1并导致STING1降解，随后在ulk1-/-和rb1cc1-/- MEF细胞中诱导NCA，表明通过蛋白过表达或化学激动剂激活STING1都能诱导不依赖于ulk1复合物或BECN1复合物但依赖于ATG5的NCA。
CQ或AMDE-1化学诱导的NCA可被V-ATP酶抑制剂Baf抑制。因此，作者想知道Baf是否对STING1诱导的NCA具有相同的作用。结果显示，它强烈抑制rb1cc1-/- MEF细胞中STING1和AMDE-1诱导的NCA。此外，SopF是沙门氏菌中一种独特的蛋白，通过ADP核糖修饰V-ATPase复合物，使V-ATPase失去招募ATG16L1的能力，可以显著抑制STING1或cGAMP诱导的NCA。而不与V-ATPase结合的SopFY224D未能下调LC3-II的水平，这表明STING1诱导的NCA需要功能性的V-ATPase。
在缺乏典型自噬的细胞中，STING1激活促进HSV-1清除
接下来。作者重点研究了自噬蛋白在STING-1介导的HSV-1清除中的作用。通过流式细胞术检测病毒感染率，发现cGAMP刺激和过表达STING1都能有效抑制HSV-1在具有较高基础水平的WT和rb1cc1-/- MEF细胞中的感染率。cGAMP和STING1过表达可进一步下调感染率。此外，单独刺激cGAMP不再能够降低ATG13-/-和ATG9A-/- HeLa细胞中的病毒感染率，这是因为STING1的基础水平较低。然而，转染STING1仍然可以有效地抑制这些HeLa细胞中的病毒感染率，并且cGAMP可以进一步降低病毒感染率。
STING1可以单独通过非典型自噬途径、单独通过典型自噬途径或单独通过免疫功能抑制HSV-1
为了阐明STING1如何发挥其抗病毒能力，作者比较了具有或不具有免疫功能的不同的STING1突变体在具有或不具有典型自噬和NCA功能的细胞中的作用。与不表达STING1的对照HeLa细胞相比，由于HeLa细胞缺乏内源性的STING1，cGAMP不能单独改变HeLa细胞HSV-1的感染率。相反，转染全长的STING1抑制了感染率。当转染STING1时，可以发现这种抑制作用，这表明HeLa细胞仍然可以抑制HSV-1，但不具有免疫功能。此外，转染STING1[1-340]仍能有效抑制HSV-1病毒的复制，并且在ATG13-/-和ATG9A-/- HeLa细胞中，cGAMP处理后的病毒感染率进一步降低，表明激活STING1仅通过不依赖于其免疫结构域和典型自噬功能的NCA途径抑制病毒。这些结果表明，除了免疫功能和典型的自噬途径外，STING1诱导的新型NCA途径也可能是抑制病毒感染的有效途径。
cGAMP和HSV-1不能刺激STING1细胞的免疫反应和炎症因子[1-340]
为了研究在缺乏典型自噬的细胞中，STING1[1-340]的这种抗病毒作用是否仍然是由炎症因素引起的，作者在cGAMP和HSV-1的作用下，检测不同细胞中炎症因子的水平。典型自噬基因Rb1cc1的缺失不影响NCA和免疫水平，因此在WT和Rb1cc1-/- MEF细胞中，在cGAMP或HSV-1病毒处理下，p-TBK1和LC3-II水平升高。同时，由于内源性全长STING1在MEF细胞中的作用，cGAMP或HSV-1可显著增加炎性细胞因子如Ifnb、Il6、Tnf、Cxcl10的RNA水平。然而，由于缺乏内源性的STING1， cGAMP刺激不能直接促进ATG13-/- HeLa细胞中炎症因子的释放。而转染STING1[FL]后，炎症因子水平升高，与cGAMP联合后，炎症因子水平进一步升高。更重要的是，转染STING1[1-340]不能像STING1[FL]那样上调炎症因子的反应水平。当将HSV-1感染应用于ATG13−/−或BECN1−/−HeLa细胞时，也证实了这种模式。综上所述，在缺乏典型自噬基因的细胞中，STING1[1-340]未能诱导免疫应答，其抗病毒作用主要与NCA活性有关，而非炎症因子的产生。
删除CTT不会改变STING1的易位和二聚化特性
cGAMP激活STING1需要将其从内质网转运到高尔基体，随后聚合以招募和激活激酶TBK1，随后激活转录因子IRF3，最终导致各种细胞因子的产生，包括I型干扰素（ifn）。作者发现，STING1激活剂cGAMP和HSV-1都能促进MEF细胞中内源性STING1的二聚化。在去除STING1原有的先天免疫和炎症反应能力后，STING1[1-340]是否仍具有与STING1相似的易位和二聚化特征，目前尚不清楚。因此，使用STING1-/- HeLa细胞瞬时转染STING1[FL]和STING1[1-340]。在非还原电泳中，两种结构均显示cGAMP处理后二聚化增加。此外，在可被cGAMP或HSV-1诱导NCA的RB1CC1-/- HeLa和BECN1-/- HEK-293T细胞中，STING1[FL]和STING1[1-340]仍可二聚体化。为了排除自噬途径可能对二聚化的影响，作者对没有自噬活性的ATG7-/- HeLa细胞进行了分析，发现STING1[1-340]仍然可以发生明显的二聚化，表明STING1的二聚化与自噬功能无关。
此外，用不同的细胞器标记物如CANX （calnexin）、LMAN1/ERGIC-53和TGOLN2/TGN46对GFP标记的STING1[FL]和STING1[1-340]进行染色。经cGAMP处理后，STING1[FL]和STING1[1-340]均可从内质网转运至ERGIC膜或反式高尔基膜。这些结果表明，c端尾巴的缺失不会改变STING1的易位和二聚化特性。
STING1诱导的非典型自噬通过溶酶体降解病毒
虽然STING1可以诱导NCA，但不清楚这种NCA过程是否仍然具有与典型自噬相似的特征。作者首先比较了野生型和未经cGAMP处理的rb1cc1−/−MEF细胞，使用非放射性方法测量长寿命蛋白质降解活性。发现，与典型自噬不同，由cGAMP介导的sting1诱导的NCA不能降解rb1cc1-/- MEF中的长寿命蛋白。然后通过透射电镜检测cGAMP处理前后rb1cc1-/- MEF的细胞结构。与典型自噬不同，STING1诱导的NCA主要诱导单膜结构。
溶酶体是与自噬体融合后降解受损蛋白或病原体的主要细胞器，因此分析了LC3和LAMP1的共定位，看看sting1诱导的NCA是否最终能与溶酶体融合。通过cGAMP或过表达STING1[FL]或STING1[1-340]激活STING1后，增加的lc3阳性结构可与溶酶体显著重叠。串联LC3实验也表明，cGAMP可以诱导更高比例的RFP+ GFP+ 点。作者推测，通过激活STING1诱导积累的LC3阳性结构可以在不影响溶酶体降解功能的情况下与溶酶体融合。然后进行蛋白酶保护实验，观察LC3-II位于亚细胞器膜内或外。可以看到，经过胰蛋白酶消化后，即使没有Triton X-100的膜透性作用，大部分脂化的LC3也被消化了，表明cGAMP刺激后，LC3-II蛋白主要位于rb1cc1−/−MEF中的溶酶体等亚细胞细胞器膜外。当溶酶体抑制剂CQ阻断HSV-1的降解时，溶酶体片段中GFP或HSV-1 gB检测到更多的HSV-1病毒，说明NCA诱导后，可以通过溶酶体途径激活STING1来降解HSV-1。
这些结果表明，STING-1诱导的NCA可以影响长寿命蛋白的降解和双膜的形成，但对lc3阳性结构与溶酶体的融合没有影响，并且可以通过溶酶体途径降解HSV-1。
文章小结
文章通过实验全面探究了STING1在抗病毒防御中的作用机制，特别是其通过NCA途径抑制HSV-1病毒的机制。
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