国自然热点——南开大学团队探究蔓荆子黄素靶向IMPDH2影响c-Myc泛素化抑制结直肠癌进展机制

结果1：在体外实验中，蔓荆子黄素对CRC具有良好的抑制作用

研究者通过执行MTT测定、克隆形成实验、EDU标记、细胞周期分析和细胞凋亡检测等系列生物学测试来探究蔓荆子黄素对CRC的作用(图1A)。首先，利用MTT实验在结直肠癌细胞系HCT116、LOVO、CoLo205细胞和HT29中筛选牡荆子黄素活性(图1A)。结果表明，在所有使用的细胞系中，牡荆子黄素均具有潜在的抗肿瘤活性(图1B-E)。蔓荆子黄素表现出优异的细胞毒性，在HCT116和LOVO细胞中的IC50值分别为1.10±0.13 μM和1.20±0.02 μM，而在CoLo205细胞和HT29中的IC50值分别为8.63±0.19μM和19.15±0.06μM。此外，它在HCT116细胞中显示出最有效的细胞生长抑制作用。有趣的是，与用于治疗CRC的主要化疗药物奥沙利铂(IC50:6.16 μM)相比，蔓荆子黄素对HCT116细胞系表现出更高的抗增殖潜力(图1F)。因此，蔓荆子黄素对HCT116细胞可能的药效。克隆形成实验用于测定蔓荆子黄素或阳性药物奥沙利铂是否影响单个癌细胞的增殖能力。结果表明，随着蔓荆子黄素剂量的增加，HCT116细胞集落的生长显著降低(图1G,1H)。EdU实验进一步检测蔓荆子黄素或奥沙利铂对HCT116细胞DNA复制的影响。实验表明，与蔓荆子黄素孵育后，进入细胞内的EdU染料逐渐减少，提示牡荆子黄酮抑制HCT116细胞增殖(图1I,1J)。此外，蔓荆子黄素(0.25μM)和奥沙利铂(0.5μM)对克隆形成和DNA复制表现出相当强的抑制能力。随后，使用流式细胞术评估药物诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞。将HCT116细胞暴露于指定剂量的蔓荆子黄素或奥沙利铂24h。结果显示，与对照组相比，蔓荆子黄素处理组的细胞凋亡和G2期阻滞增加(图1K,1L)。此外，与5μM奥沙利铂处理组相比，2.5μM低浓度的蔓荆子黄素表现出相当的抗肿瘤特性。以上实验发现蔓荆子黄素在HCT116结直肠癌细胞株中具有显著的抑制细胞增殖能力。并且还能诱导细胞凋亡并导致细胞周期的停滞，这些结果表明蔓荆子黄素具有显著的抗肿瘤潜力。

图1 蔓荆子黄素对CRC细胞的抑制作用

结果2：体内实验揭示蔓荆子黄素抗肿瘤活性，且无明显毒副作用

上面的实验结果从体外证实蔓荆子黄素的处理诱导HCT116细胞产生多种细胞反应，具有抗肿瘤的潜力。研究者随后评估了蔓荆子黄素是否具有体内抗肿瘤作用。他们通过在BALB/c裸鼠体内植入HCT116细胞建立肿瘤模型，来评估蔓荆子黄素的体内抗肿瘤效果。用2.5mg/kg和10mg/kg剂量的蔓荆子黄素以及2.5mg/kg剂量的奥沙利铂，每两天腹腔注射(IP)一次小鼠，共注射九次。在治疗期间，每2天测量小鼠的体重和肿瘤体积。结果发现，与对照组相比，蔓荆子黄素和奥沙利铂均减少了肿瘤的体积与重量，延缓了肿瘤的生长从（图2A、C、D）。并且在给药期间，对照组、2.5mg/kg和10mg/kg蔓荆子黄素处理组之间并没有显著的体重变化（图2B）。相反，奥沙利铂给药组使小鼠的体重下降。以上实验结果显示，蔓荆子黄素能有效减缓肿瘤的生长速度，并且在整个实验过程中，对小鼠的体重没有造成明显的负面影响。这些发现证实了蔓荆子黄素在体内具有抑制肿瘤的活性的作用。

图2 蔓荆子黄素在BALB/c裸鼠荷HCT116肿瘤模型中的体内抗肿瘤作用，为期17天

结果3：蔓荆子黄素直接靶向IMPDH2抑制CRC

为了探究蔓荆子黄素的抗癌机制，采用CETSA鉴定其直接作用靶点。HCT116细胞的等量蛋白裂解液在室温下用或不用蔓荆子黄素(10μM)处理30分钟，然后使用PCR机在49℃加热3分钟。样品彻底离心，上清液使用SDS-PAGE进行定量和分离。随后，用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。并在LC-MS/MS分析之前被切割和酶解的样品(图3A,3B)。

通过热稳定性实验验证蔓荆子黄素是否直接靶向IMPDH2。结果发现，与蔓荆子黄素(10μM)孵育后，IMPDH2的热稳定性在49°C，53°C和59°C下增加(图3C,3D)。随后研究者通过SPR结合实验评估了蔓荆子黄素与IMPDH2之间的结合强度，蔓荆子黄素与IMPDH2相互作用的Kd值为23.24 μM，验证了蔓荆子黄素与IMPDH2之间的结合关系(图3F)。此外，研究者还检测了IMPDH2在HCT116，LOVO，CoLo205细胞和HT29细胞系中的表达水平。结果发现，HCT116和LOVO细胞系在WB分析中显示IMPDH2水平较高(图3E)。这一趋势可能解释了结果一中，HCT116细胞中细胞毒性最强的现象(图1B-E)。

为了验证IMPDH2在蔓荆子黄素诱导的抗肿瘤效应中的作用，研究人员在HCT116细胞中进行了IMPDH2基因的敲低和过表达实验。研究者通过MTT实验探究蔓荆子黄素对IMPDH2基因敲低和过表达细胞细胞活性的影响。实验结果显示，当IMPDH2基因在HCT116细胞中被敲低时，蔓荆子黄素对HCT116细胞的活性抑制效果显著减弱，IC50值增加了将近2倍(图3G)，另外，研究者在分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据库之后发现，肿瘤组织中IMPDH2蛋白水平显著高于癌旁非肿瘤组织(图3H)。这些研究结果表明蔓荆子黄素直接靶向IMPDH2，IMPDH2 在蔓荆子黄素的抗癌作用中扮演着重要的角色。

图3 在CRC细胞中，蔓荆子黄素与IMPDH2直接结合

结果4：IMPDH2通过减少c-Myc的泛素化来稳定c-Myc

c-Myc对CRC的各个方面的发展至关重要，如促进细胞生长、侵袭、转移和对化疗的抵抗。先前的研究报道了c-Myc和IMPDH2表达之间的关系。例如，(1)c-Myc在多种肿瘤细胞中转录激活IMPDH1/2的表达；(2)在恶性黑色素瘤中，c-Myc缺失抑制核苷酸代谢，包括IMPDH2、胸苷酸合成酶(TS)和磷酸核糖焦磷酸合成酶2(PRPS2)的水平；TS和IMPDH2是c-Myc的直接靶基因；(3)在临床表型的胰腺导管癌样本中，c-Myc与IMPDH2的表达呈正相关。然而，c-Myc与IMPDH2之间的直接物理相互作用尚未见报道。为了阐明IMPDH2在CRC中的分子功能，研究了其与IMPDH2和c-Myc的直接相互作用。FpClass网站是预测蛋白质相互作用的工具。它为给定的查询蛋白提供了一个潜在的相互作用蛋白列表。本研究使用FpClass网站预测IMPDH2的相互作用蛋白。IMPDH2与Myc在FpClass网站上表现出互作关系(图4A)。同时，IMPDH2和c-Myc在CRC组织中的表达存在显著相关性(图4B)。免疫荧光结果显示，在人CRC组织和HCT116细胞中，IMPDH2与c-Myc共定位(图4C-E)。然而，IMPDH2和c-Myc在正常组织中弱表达(图4C)。共定位和Co-IP实验的结果表明，IMPDH2和c-Myc可以直接相互作用(图4F)。此外，MST实验证实野生型重组IMPDH2和c-Myc蛋白相互结合，Kd值为414.94 nM(图4G)。这些数据表明，IMPDH2可能参与调节CRC细胞中c-Myc的活性。为了证明这一点，在HCT116和LOVO细胞系中操纵IMPDH2的水平，并通过Western blot分析监测c-Myc的表达。这些发现表明，在HCT116和LOVO细胞中，降低IMPDH2显著降低了c-Myc的含量(图4H)，而IMPDH2过表达导致HCT116细胞中c-Myc的含量增加(图4I)。

先前的研究表明，c-Myc的水平受泛素化降解速率的变化控制，因此IMPDH2与c-Myc的结合可能会影响c-Myc的稳定性。在随后的实验中，用蛋白合成抑制剂CHX处理野生型和oeIMPDH2-CRC细胞，检测c-Myc的降解率。这些数据表明，在过表达IMPDH2的CRC细胞系中，c-Myc的降解速率显著降低(图4J-M)。同时，通过免疫共沉淀比较了野生型和shIMPDH2-HCT116细胞系中与c-Myc结合的泛素的量，在shIMPDH2细胞中观察到泛素-c-Myc相互作用水平增加，表明IMPDH2通过减少泛素化降解来增强c-Myc的稳定性(图4N)。这些结果在LOVO细胞系中也得到了验证(图4O)。这些实验表明IMPDH2与c-Myc可以直接结合，并且IMPDH2在调节c-Myc稳定性方面发挥着重要作用。

图4 IMPDH2与c-Myc相互作用，通过抑制其泛素化增强c-Myc的稳定性

结果5：蔓荆子黄素通过直接结合IMPDH2破坏IMPDH2与c-Myc的相互作用

由于蔓荆子黄素在CRC细胞中靶向IMPDH2，而IMPDH2与c-Myc存在相互作用，因此可推测蔓荆子黄素可能影响IMPDH2与c-Myc的结合。通过对接分析研究蔓荆子黄素与IMPDH2/c-Myc复合物的结合模式。结果表明，在c-Myc/IMPDH2复合物中，蔓荆子黄素与Tyr-249形成氢键。此外，蔓荆子黄素与氨基酸残基Val953、Val499、ILE950和LEU951形成疏水相互作用(图5A,5B)。还进行了三次分子对接计算，以确保结果的可靠性和准确性。计算得结合能为-34.436±1.618 kcal/mol。另外，根据文献估算预测的抑制常数(pKi)。计算出预测的结合常数(pKi,in µM)为2.514±1.572。基于对接结果，研究了蔓荆子黄素是否影响CRC细胞中c-Myc的表达水平。免疫荧光和WB实验结果可以观察到，蔓荆子黄素能有效抑制 HCT116 和 LOVO 细胞中 c-Myc 蛋白的表达（图5C、D）蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转了蔓荆子黄素诱导的HCT116和LOVO细胞系中c-Myc的减少(图5D)。因此研究者推测蔓荆子黄素破坏了IMPDH2/c-Myc复合物，并在HCT116和LOVO细胞中，通过Co-IP实验验证了蔓荆子黄素对IMPDH2和c-Myc结合的影响，在蔓荆子黄素存在的情况下，IMPDH2与c-Myc这种相互作用被蔓荆子黄素减弱(图5E、5F)。同时，MST数据表明，蔓荆子黄素可以解离IMPDH2与c-Myc的结合（图5G）。

结果四中已经证实，IMPDH2能够与cMyc直接结合，通过减少c-Myc的泛素化降解过程来增强其在细胞中的稳定性。因此研究者就想探究一下，在存在和不存在蔓荆子黄素的情况下，HCT116细胞中c-Myc的降解水平。蛋白实验可以看出，蔓荆子黄素增加了泛素与c-Myc的结合，增加了c-Myc的泛素化(图5H)，前面图5D提到，蔓荆子黄素能有效抑制HCT116和LOVO细胞中c-Myc蛋白的表达，蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转了蔓荆子黄素诱导的HCT116和LOVO细胞系中c-Myc的减少，也就说明，蔓荆子黄素通过直接结合IMPDH2来破坏IMPDH2/c-Myc复合物，从而降低c-Myc蛋白水平。随后研究者探究了在加或不加MG132 (5 μM)的情况下，用MTT法检测细胞活力。在蔓荆子黄素处理HCT116细胞和LOVO细胞后，IC50值分别为1.27μM和1.77μM，而在MG132处理后，蔓荆子黄素对HCT116和LOVO细胞的IC50值显著增加，也就是说，在MG132处理后，蔓荆子黄素对结肠癌细胞的促凋亡作用被减弱(图5I-K)。c-Myc调节多个参与细胞周期进程的基因，包括G2/M转化所需的基因，那么前面结果一中所观察到的蔓荆子黄素诱导的HCT116细胞G2期阻滞，可能与干扰IMPDH2/c-Myc通路有关(图1L)。蔓荆子黄素可能通过抑制c-Myc来下调这些基因的表达，从而将细胞周期进程阻滞在G2期。

图5 蔓荆子黄素直接与IMPDH2结合，破坏IMPDH2与c-Myc的相互作用

结果6：蔓荆子黄素通过靶向IMPDH2抑制c-Myc表达发挥体内抗肿瘤作用

前面的结果从机制上发现了蔓荆子黄素靶向IMPDH2，影响了IMPDH2与c-Myc复合物的形成，增加了c-Myc的泛素化降解，紧接着，研究者使用阴性对照(NC)和shIMPDH2-HCT116细胞系在CRC异种移植小鼠模型，验证蔓荆子黄素的靶向和抗癌作用。

研究者测量了肿瘤的体积及重量，结果发现，经蔓荆子黄素处理后，CRC异种移植小鼠模型中肿瘤生长明显受到抑制，并且IMPDH2基因的敲低同样能有效减少肿瘤的增殖（图6A、C）。但是在IMPDH2被敲低后的CRC异种移植小鼠模型中，蔓荆子黄素并没有带来额外的肿瘤生长抑制效果。从图B的结果可以看到，以上一些CRC异种移植模型对小鼠的体重没有影响。

随后，研究者通过免疫组织化学和免疫荧光实验评估了IMPDH2、c-Myc、以及上皮间质转化（EMT）标志物Vimentin和E-cadherin水平。上皮间质转化（EMT），上皮间质转化（EMT）的激活是癌细胞转移的关键过程，EMT 的特征在于上皮细胞标志物（例如E-cadherin钙黏蛋白）缺失，间充质细胞标志物（例如vimentin波形蛋白和纤连蛋白）的表达上调。结果发现，蔓荆子黄素能够降低c-Myc和vimentin的表达水平，同时增强E-cadherin的表达（图6D-F），shIMPDH2组和shIMPDH2+蔓荆子黄素组细胞中c-Myc、Vimentin和E-cadherin的表达水平无明显差异。也就是说，蔓荆子黄素可能抑制上皮间质转化（EMT）这一过程。通过上面的CRC异种移植小鼠模型中实验结果，研究者发现蔓荆子黄素在体内可以靶向IMPDH2，进而抑制cMyc的表达，抑制EMT这一过程，发挥抗肿瘤作用。

图6 蔓荆子黄素在荷HCT116肿瘤的BalB/c裸鼠模型中的体内抗癌作用依赖于IMPDH2

结果7：蔓荆子黄素在体内外均能降低结直肠癌的转移

随后在体外和体内评估了蔓荆子黄素预防肿瘤转移的能力。采用HCT116和LOVO细胞进行划痕实验和细胞侵袭实验。与对照组相比，蔓荆子黄素引起了浓度依赖性的细胞转移和侵袭减少(图7A-D)。蔓荆子黄素破坏了IMPDH2与c-Myc之间的相互作用，导致c-Myc的不稳定，进而抑制c-Myc的表达。在结直肠癌中，c-Myc通过多种途径调控结直肠癌从原发病灶向远处器官扩散的过程。此外，IMPDH2和CDH1(E-cadherin基因)在CRC组织中的表达存在显著相关性。Western blotting检测蔓荆子黄素对c-Myc表达及EMT相关标志物的影响。在HCT116和LOVO细胞中，蔓荆子黄素有效降低c-Myc水平并影响EMT标志物，包括E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9和Snail(图7E-J)。根据体外实验结果，通过尾静脉注射野生型、shIMPDH2-和oeIMPDH2-HCT116细胞系来确定蔓荆子黄素对体内转移的影响。研究结果表明，与野生型组相比，IMPDH2敲低阻断了HCT116细胞的肺转移，而oeIMPDH2显著促进了HCT116细胞的肺转移(图7K,7L)。此外，与相关组相比，蔓荆子黄素处理降低了野生型HCT116和oeIMPDH2 HCT116细胞的体内转移。shIMPDH2-或shIMPDH2+蔓荆子黄素-处理组未观察到肺转移(图7K,7L)。这些数据表明，IMPDH2在促进CRC转移中起着至关重要的作用，并且蔓荆子黄素可以通过靶向IMPDH2降低IMPDH2水平，从而在体外和体内阻碍CRC的转移。

图7 蔓荆子黄素通过靶向IMPDH2/c-Myc复合物调节EMT过程，并在体外和体内抑制肿瘤的侵袭和转移