点评丨田瑞军（南方科技大学）、董梦秋（NIBS）、韩硕（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）
图1. APEX2-SOPP3介导的邻近标记反应原理图
图2. APEX2-SOPP3介导的线粒体与内质网交界面内邻近标记反应
这篇论文提出了一种创新的邻近标记（PL）技术，解决了传统方法中存在的多项挑战，具有很高的应用潜力。文章描述了一种基于光控制的APEX2激活方法，通过使用SOPP3（单态氧光敏蛋白）与APEX2结合，在不需要外源H2O2的情况下，通过蓝光激活产生反应性ROS，从而高效、精确地标记邻近蛋白质。传统的邻近标记技术如APEX2依赖于外源性H2O2，往往伴随细胞毒性，这大大限制了其在活细胞中的应用。与此相比，SOPP3介导的APEX2激活不仅避免了H2O2的使用，而且可以通过光照精确调控标记过程，且该过程无细胞毒性，标记速率高，5秒内即可完成。
作者通过多种实验验证了该技术的高效性和空间分辨率，特别是在不同亚细胞位置（如线粒体外膜、内质网及细胞表面）上的应用，展示了其在探测动态蛋白质相互作用中的潜在优势。通过定量蛋白质组学分析，本论文还识别了大量新的线粒体-内质网接触位点蛋白质，进一步证明了该方法不仅可以确认已知相互作用，还能发现新的潜在蛋白质相互作用。与传统的BioID和TurboID方法相比，该系统显著提高了时间分辨率。另外，该方法的低功率光照需求（50 mW/cm²）保证了其在活细胞中的安全性，避免了其他方法中可能引起的细胞损伤。与LITag和LOV-Turbo等现有光激活系统相比，SOPP3介导的APEX2激活在效率和安全性上具有优势。总之，本文介绍的SOPP3介导的APEX2系统是一项新的邻近标记技术，具有高时间分辨率优势，为研究动态细胞机制的蛋白质组学分析提供了新颖的工具。
有时候专业领域内的难题需要局外人帮忙解决。中国科学院上海营养与健康研究所潘巍峻团队无意间发现，一种在蓝光照射下高效产生单线态氧的小蛋白SOPP3和APEX2联用可以在不需要外加双氧水的情况下实现邻近标记，而且速度非常快，仅5-10秒就能完成标记反应。与同类最新技术LITag（Light-induced Interactome Tagging，Hananya, N., PNAS, 2023）相比，SOPP3-APEX2将标记所需的光照强度降低了一个数量级，从而避免了蓝光照射产生的细胞毒性。SOPP3-APEX2让三无（无需外加双氧水、无细胞毒性、无需等待）、双高（高时间分辨、高空间分辨）活细胞邻近标记技术成为现实，为精准刻画蛋白-蛋白相互作用的动态提供了更高效的工具，应用场景无限。
从质谱分析的角度，SOPP3-APEX2让人既兴奋又倍感压力。邻近标记蛋白的鉴定依赖质谱技术。高时空分辨的邻近标记意味着被标记蛋白的种类和绝对量骤减，富集纯化过程中更容易被未标记蛋白污染。因此，质谱鉴定的灵敏度和准确度必须上一个台阶。除了用相对定量方法排除背景蛋白，可能也有必要鉴定被生物素-苯酚修饰的肽段，以降低假阳率。作为质谱人，我深知这是一个巨大的挑战。但是，办法总会有的。
工程化的过氧化物酶APEX最早由Alice Ting实验室开发，原本用作电子显微镜的报告基因（Martell, Nat Biotech 2012），于2013年首次用于邻近标记空间蛋白质组学和鉴定细胞中时空特异的分子组分（Rhee, Zou, Science 2013），建立了邻近标记方法的范式，而后又进一步通过定向进化升级为活性更高的APEX2（Lam, Nat Method 2014）。过去十年间，APEX2的广泛应用促成了一系列有趣的发现（例如朱冰课题组Ma, Nature 2024），但始终受到标记时空分辨率、反应细胞毒性、标记可控性等问题的困扰。
本篇工作中，潘巍峻团队屈大均等意外地发现了遗传编码的光敏剂蛋白SOPP3在光照条件下可激活APEX2，并阐明了SOD依赖的反应机制，为应用APEX2邻近标记提供了全新的思路。该策略的优势在于可以通过蓝光的开启和关闭灵活控制反应起止，有效减少了细胞毒性。同时，该工具的亮点在于可将激活模块SOPP3和标记模块APEX2分别表达于不同的亚细胞区域，从而实现空间交集处特异的标记与组成鉴定，相较于现有的split APEX2（高背景，低活性）具有巨大优势，在研究细胞器互作等领域有很大前景。此外，作者还将该方法从分子水平拓展到了细胞层面，实现了具有极高时间分辨率的邻近细胞间互作标记。非常期待未来SOPP3-APEX2方法的推广应用所带来的生物学新发现。
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