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第一作者：易盛炜 博士生
https://doi.org/10.1016/j.envint.2024.108915
• HDS可有效富集氯霉素、利福霉素和MLS等抗性基因。• Bacillus、Rhizobium和Rossellomorea等是HDS所富集ARGs的宿主菌。• HDS富集后土壤中cat、macB和rpoB等ARGs的丰度降低了36%-85.7%。• HDS增强了ARG宿主菌的趋化性并加快了宿主菌生物膜的形成。抗生素抗性基因（ARGs）及其宿主病原微生物对公众健康和土壤生态构成了严重威胁，而现有的药物和抗菌材料在抑制ARG携带者的同时会不可避免地杀死有益微生物，因此从土壤中快速富集和分离ARG及其载体正成为控制ARG扩散的重要策略。
铁载体对于土壤微生物间微量元素的循环至关重要，且其对于抗生素的转运及抗菌特性也受到广泛关注。为此，本文探索了一种利用荧光假单胞菌HMP01分泌的异羟肟酸铁载体（HDS）原位捕获富集ARG及其载体的方法。在这项研究中，我们证明了HDS在土壤环境中显著地原位捕获和富集包括氯霉素、MLS、利福霉素和四环素等抗性基因，富集效率分别比对照组高1473倍、38倍、17倍和5倍。具体而言，主要富集的ARGs是rpoB、mphL、catB2和tetA（60），而Bacillus、Rhizobium、Rossellomorea和Agrobacterium等为ARG的主要宿主菌。这种富集主要是由趋化性基因（如cheW、cheC和cheD）的上调以及富集菌群内生物膜的快速形成引起的。值得注意的是，HDS富集后，水稻土中代表性ARG（如cat、macB和rpoB）分别显著降低了36%、85.7%和72%。本研究揭示了HDS作为小分子绿色捕获剂在土壤环境中削减ARGs及其载体的潜在应用前景。
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HDS富集后的样本中发现了18种ARG类型，共计1020种ARG亚型，ARG主要由与氯霉素、多药、利福霉素和MLS等耐药基因组成，丰度分别为46.1%、20.6%、15.2%和13.4%。大量富集的ARG亚型主要为catB2、rpoB、mphL和tetA，其在土壤-植物系统中具有高度传播性、人类可接触性和致病性，均属于高风险ARGs。共网络分析显示，氯霉素耐药基因catB和四环素耐药基因tetA与其他ARGs之间存在高相关性和连通性，表明catB和tetA是所富集ARGs的核心基因，在耐药菌中发挥着重要作用。 图2 （a）HDS从水稻土中所富集ARGs的类型和丰度；（b）HDS对显著富集的4种ARGs亚型丰度的影响；（c）HDS显著富集的ARGs共现网络分析
PCA分析发现HDS富集过程中ARG组成和结构存在显着变化。HDS富集组变异的主要贡献因子是rpoB、mphL、catB2和tetA（60）等ARG，其在HDS富集组的丰度高于CK组。此外rpoB、mphL、catB2和tetA（60）作为共生网络节点与其他ARGs和微生物形成高度相关的网络，主要是由于ARGs通过垂直和水平基因转移在土壤环境中的传递。 图3 （a）主成分分析图；（b）HDS富集ARGs的主要成分贡献最大的前10个ARGs；（c）HDS富集后rpoB、mphL、catB2和tetA（60）丰度的变化
HDS在门水平上主要富集的为厚壁菌门，而在属水平上主要富集芽孢杆菌属、根瘤菌属和农杆菌属等。需要注意的是，富集的芽孢杆菌携带7种ARG，包括氯霉素类和大环内酯类等抗性基因。具有大环内酯类抗性基因的宿主占厚壁菌门的53.5%，其次分别是携带万古霉素类、氯霉素类和四环素类抗性基因的宿主。这些细菌属和ARGs在共现网络中表现出显著的正相关边，尤其芽孢杆菌属、罗氏菌属和假单胞菌属与14种亚型ARGs高度相关，表明ARGs和细菌之间存在复杂的共生联系。 图4 （a）HDS所富集细菌在门和属水平上的变化；（b）门水平上HDS所富集细菌携带的ARGs丰度占比；（c）属水平上HDS所富集细菌携带的ARGs丰度占比；（d）HDS所富集ARGs与属水平细菌的共网络分析
KEGG功能注释表明，在HDS富集组中，外源性生物降解和代谢、细胞运动和细菌趋化性特别增强。细菌趋化性通路中cheW、cheC和cheD基因的丰度显著增加，这些基因的增强上调改善了细菌鞭毛的组装过程，有效地提高了细菌运动能力。微生物群落的结构完整性在很大程度上取决于微生物快速感知、适应和影响其与环境相互作用的能力，细菌使用它们的趋化性信号系统在复杂的环境中移动并根据环境变化调整其新陈代谢。因此，富含 HDS 的细菌中的这些受体可以感知化学引发因子（如HDS）的变化，导致运动行为的改变，从而将细菌吸引到富含HDS的位点。图5 细菌趋化性KEGG通路图。红色字体表示丰度增加的关键基因。“±P”和“±m”分别为磷酸化/去磷酸化和甲基化/去甲基化。
利用筛得的Acinetobacter pittii AEP01菌株进一步研究了HDS对ARGs及其载体富集的分子机制。菌株AEP01对所研究的四种抗生素均表现出显著的耐药性，其中对万古霉素的耐药性最高。结果表明HDS能有效促进菌株AEP01生物膜的形成，为ARGs及其宿主提供保护层，有效限制抗生素的侵入。此外，它还促进了ARGs在生物膜内微生物之间的水平基因转移，增强了细菌抗性。随着孵育时间的增加，菌株AEP01向培养皿中央小孔（含有100 mg/L HDS）的方向迁移，相对趋化指数（RCI）值比对照组高2.4倍，而cheW表达量高出两倍，进一步验证了菌株 AEP01对HDS的趋化效应。 图6 （a）Acinetobacter pittii AEP01对HDS的趋化性；（b）毛细管倾斜试验细菌菌落计数和相对趋化指数；（c）HDS对趋化基因CheW表达的影响
测定了HDS富集前后稻田和蔬菜土壤中代表性cat、macB、rpoB和tetA的基因丰度。结果表明，HDS原位富集显著降低了稻田和蔬菜土壤中的cat丰度，分别降低了50%和29.4%。此外，水稻土中cat、macB和rpoB丰度分别下降了36%、85.7%和72%。Shannon指数和丰富度指数证实了ARGs响应HDS变化的组成差异，HDS土壤平均归一化随机性比（NST）指数表明随机过程对土壤中ARG的富集具有显著的影响，并且HDS富集组的ARG迁移率更高。图7 （a）HDS富集后水稻和蔬菜土壤中关键ARGs丰度的变化；（b）HDS富集后水稻土ARGs多样性（ARGs的Shannon指数与丰富度，差异基于ARGs的Bray-Curtis距离；ARGs归一化随机比率指数）
综上所述，HDS通过上调细菌群落内趋化性基因（如cheW、cheC和cheD）的表达水平，加速细菌生物膜的形成，实现了对土壤环境中氯霉素、MLS、利福霉素和四环素等抗性基因的原位富集。这项研究的结果为铁载体作为一种降低环境中ARGs及其宿主的小分子有机物的潜在应用提供了新的见解。HDS有望发展成为一种高效和环保的生物捕集和富集剂，用于ARGs在土壤中的原位富集。项目致谢：本研究受到了国家环境保护工程中心城市土壤污染控制与修复专项基金（USCR-202208）、国家自然科学基金（No. 22176161）、湖南省研究生科研创新项目（No. CX20230554）以及湖南省高校科技创新团队项目资助。李峰，博士，教授，博士生导师，国家农产品产地重金属污染防治协同创新联盟理事，湖南省土壤污染防治专家库成员，长沙市土壤修复产业技术创新战略联盟理事，湘潭大学韶峰学者，Int. J. Environ. Res. Pub. He.和Front. Environ. Chem.杂志客座编辑。主要从事土壤污染过程控制与生物修复研究，已在Environ. Sci. Technol.、J. Hazard. Mater.和Bioresour. Technol.等国际国内知名学术期刊发表SCI论文50余篇；授权发明专利8项，制订1件团体标准《湖南省环境健康监测及风险评估技术规范》（T/HNAEPI 007-2022）；主持国家自然科学基金区域创新发展联合基金重点支持项目子课题1项、国家自然科学基金面上项目2项、湖南省自然科学基金面上项目2项、中国博士后科学基金面上一等1项和特别资助1项、湖南省重点研发计划项目1项、生态环境部全国重点地区环境与健康专项调查等多项课题；获湖南省自然科学三等奖（排名第三，2020年），湖南省优秀硕士学位论文指导教师（2020年）。易盛炜，湘潭大学环境与资源学院2022级博士研究生，主要研究方向为稻田土壤中复合污染的阻控与修复。目前主持湖南省研究生科研创新项目重点项目1项，以第一作者在Environ. Int.、J. Hazard. Mater.和Environ. Microbiol.等SCI期刊发表论文4篇，授权发明专利2项。投稿、转载、合作、申请入群可在后台留言（备注：姓名+微信号）或发邮件至sthjkx1@163.com
