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Prime Editing（PE）是一种无需双链断裂的精确基因编辑技术，能够实现碱基替换、小片段插入和删除，理论上可校正90%的人类遗传疾病相关突变，具有广泛的研究和治疗潜力。
然而，其应用受限于较低的编辑效率和较高的插入/缺失突变（indels）率，主要原因在于pegRNA的3'延伸区与靶序列高度互补，形成二级结构，阻碍其与nCas9和靶DNA的结合。此外，pegRNA在编辑后持续引导nCas9切割已编辑位点，导致DNA损伤和indels的增加。
2025年1月2日，Nature Communications在线发表了中科院天津工业生物技术研究所张学礼、毕昌昊团队的最新研究成果：‘Mismatch prime editing gRNA increased efficiency and reduced indels’，该研究通过引入错配引导RNA（mpegRNA）来改进Prime Editing（PE），从而提高基因组编辑效率并减少插入/缺失突变（indels）的形成。
mpegRNA 在不影响性能的情况下，将编辑效率提高了 2.3 倍，并将插入缺失水平降低了 76.5%。将 mpegRNA 与 epegRNA 相结合可进一步将 PE4max/PE5max 系统的效率提高 14 倍或 2.4 倍，凸显了其在研究和治疗中的潜力。
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引入错配的mpegRNA提升编辑效率降低InDel的机制pegRNA的3'延伸与原间隔区（靶序列）高度互补，容易形成二级结构，阻碍了pegRNA与Cas9蛋白及目标DNA序列之间的有效相互作用。而mpegRNA通过在原间隔区引入不匹配的碱基（尤其位于N6至N10位置），降低了与3'延伸的互补性，从而减少了二级结构的形成。（图1 a）在Prime编辑过程中，编辑完成后，原始的pegRNA与编辑后的位点不再互补，理论上应该终止编辑过程。但由于Cas9的错配容忍特性，即使pegRNA与编辑后的位点不完全互补，nCas9仍能结合并持续切割目标位点。mpegRNA策略通过在编辑后引入更多的非互补核苷酸，降低了PE复合体对编辑位点的亲和力。编辑后mpegRNA与目标位点的非互补核苷酸增多，有助于终止PE编辑过程，防止持续的DNA损伤，从而提高了编辑效率。（图1 c）mpegRNA的结构优化和编辑终止机制共同作用，使得Prime编辑过程更加精准和高效。测试pegRNA与sgRNA共转染诱导的InDel比单独使用sgRNA更多，说明传统pegRNA在编辑后仍能靶向基因组，导致InDel增加。而mpegRNA策略通过减少二级结构和终止编辑过程，优化了编辑过程，降低了InDel的发生。（图1 b）![]()
图1
在标准pegRNA中，protospacer和PBS之间的某些碱基距离较短，表明这些区域可能存在强互补导致的二级结构。引入错配后（如N6-mpegRNA和N7-mpegRNA），某些位置的碱基间距显著增大，表明错配成功破坏了局部互补性，减弱了不必要的碱基配对，提高了pegRNA的功能灵活性。（图2 b）在N6-mpegRNA和N7-mpegRNA中，protospacer中对应位置的碱基间距显著增大（如N6位置的距离从5 Å增至8.6 Å），说明这些错配有效破坏了二级结构。（图2 c）在N6-mpegRNA中，错配（C-6）显著增加了与靶DNA碱基（U-121）的距离，破坏了局部的碱基配对。对比ST-pegRNA，错配使得pegRNA的局部结构更加松散，减少了局部二级结构的形成，优化了pegRNA的结合效率。（图2 d）N6-mpegRNA 在 scaffold（支架）区域的解开程度更高，结构更加延展，这有助于提高编辑效率；N7-mpegRNA 的 scaffold 部分出现了明显的折叠和扭曲，干扰了与 Cas9 的有效结合，导致编辑效率下降。N7 的错配尽管增加了碱基距离，但其 scaffold 的结构畸变导致编辑效率下降。（图2 e）这些结果表明，mpegRNA 的优化不仅取决于错配位置，还与错配对整个 RNA 结构的影响密切相关。综上所述，AlphaFold 3 的结构预测验证了 mpegRNA 在优化 prime editing 效率方面的设计逻辑，特别是在 N6-N10 范围内选择错配可以显著改善编辑性能，同时减少indel 的发生率。![]()
图2
该研究提出的mpegRNA策略显著改进了Prime Editing技术，解决了效率和安全性方面的关键瓶颈，为基因编辑技术的研究和临床应用提供了重要工具。
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