导读：侵入式脑机接口的闭环控制技术一直是这个领域的核心技术壁垒，对于高级应用比如视觉修复和认知疾病治疗都需要闭环调控。本文介绍一种基于光遗传学的侵入式脑机接口的神经闭环调控技术，以及在非灵长类动物上的应用。
本文总结：
使用兴奋性光感受器的闭合回路光遗传刺激可精确操纵转基因小鼠和麻醉非人类灵长类动物的大脑片中的神经动力学。
兴奋性刺激对神经回路的影响取决于其相对于持续振荡的瞬时相位何时被施加，并且可以通过闭合环路的方式进行控制。
对于闭环调控，在什么时候给于刺激的决定性因素是神经网络的动力学特性。如果弄清楚了调控对象神经动力学的状态集合和状态间切换的条件，刺激给于的时间方案就会清晰。
对与体内调节，基于闭合回路相位偏移的爆发持续时间调节显著依赖于闭合回路相位偏移。
相同的刺激模式通过开环方式输送却无法衰减癫痫发作，即使该模式是在癫痫周期的相同阶段开始，这是因为每个运行之间引入的噪声导致了微妙的不同。
以下科普内容来自Nature Biomedical Engineering文章：
摘要
电神经刺激在治疗神经系统疾病方面是有效的。但与之相关的记录伪影通常限制了其应用。对于闭环刺激，通过同时进行电记录和光遗传学刺激，可以实现对脑活动的实时连续闭环控制。在这里我们表明，使用兴奋性光感受器的闭合回路光遗传刺激可精确操纵转基因小鼠和麻醉非人类灵长类动物的大脑片中的神经动力学。该方法在静止组织中产生振荡，在活跃组织中增强或抑制内源模式，并调节由抗惊厥剂4-氨基吡啶诱导的类似癫痫发作的爆发。基于光学刺激相依赖效应的非线性模型再现了与癫痫震荡相关的局部场电位周期的调节，这可以通过系统地改变其变异性、熵及其持续时间和强度的变化来证明。我们也表明，使用皮层内光电极可以提供闭合回路光遗传神经刺激。
由于用于光遗传学的光刺激可以不干扰同时进行的电记录，这些刺激可以通过脑信号连续实时地调节，以允许与局部网络的真实闭环交互。尽管有相当大的理论动机，但迄今为止，闭环光遗传刺激的实验演示仅限于体外准备和在啮齿动物中正常脑节律的体内实验。在这里，我们旨在通过证明非人类灵长类动物（NHP）中的网络动力学闭环操纵的可行性，并研究其对病理性癫痫样活动的影响来推进这项技术向人类治疗应用的发展。此外，我们比较了通过外部光源提供的光学刺激与包含封装发光二极管（LEDs）的植入式光源之间的差异。虽然光遗传学允许使用各种不同的感光蛋白靶向不同类型的细胞，但我们在这里关注的是使用高效的离子通道感光蛋白的闭环光遗传刺激（CLOSe），而无需限制表达特定抑制性神经元亚型。我们假设通过改变刺激相对于持续活动的时间，我们可以对局部网络产生不同的影响，从而增加光遗传学实现的神经动力学控制的时间维度。
闭环调控驱动静止脑片中的振荡
我们首先在表达选择性兴奋性锥体细胞通道蛋白的转基因小鼠中研究了CLOSe。这些转基因小鼠通过表达通道蛋白Rhodopsin来表达通道蛋白（Emx1-ChR2）。刺激的方式是记录局部场电位（LFP）时，使用一个有限脉冲响应（FIR）滤波器，该滤波器对信号进行带通滤波和相移（图1a），这些处理后的结果并实时发送到控制光纤中光刺激强度。在每个实验会话内，我们用相同的滤波频率但不同的相移（0、45°…、315°）顺序随机化地输送CLOSe阶段，并插入无刺激的控制阶段。我们设置闭环算法的阈值，使得偶发的小幅LFP波动跨越阈值并触发光刺激。由此产生的行为取决于LFP和刺激之间的相位差。对于某些CLOSe相位差，没有持续活动被激发，而其他相位差则驱动了强且持久的振荡（图1b）。振荡频率随着闭环滤波器频率的变化系统地变化，表明振荡反映了闭环系统的动力学（即光刺激导致神经元活动，然后进一步刺激产生正反馈环路），而不是组织固有的振荡特性。
图一：闭环调控驱动静止脑片中的振荡。
闭环调控调节体内自发活动
接下来，我们研究了CLOSe对两种NHP体内脑内源性活动的影响。在记录方面多接触电极用于记录LFP和单个单元，而开环刺激（以1 Hz频率施加200或500毫秒脉冲）和基于光遗传的闭环调控的光刺激则通过插入皮质的optical fiber或植入的LED光源提供（图2a）。图2b左栏显示了ChR2驱动的开环刺激的例子。在响应光脉冲时观察到了大型LFP偏转，并伴随着神经放电的爆发。LFP响应对开环刺激的极性随深度变化，正如生理反应所预期的那样（图2b左列）。当使用不在视蛋白吸收光谱范围内的频率或在无视蛋白表达的动物中使用蓝光时，未观察到此类响应；
图二：开环刺激实验结果。
与脑片类似，在CLOSe+驱动下，LFP和神经元表现出强烈的振荡响应。由周期触发的LFP平均值揭示（图3e）。与开环响应一样，驱动振荡的极性也随深度而变化。在每个情况下，这种深度剖面类似于在无刺激控制阶段观察到的内源活动，表明CLOSe +驱动了自然网络活动模式（图3e、f）。我们感兴趣的是在CLOSe+条件下，单个细胞的活动是否比没有刺激时更同步于LFP。Spike触发平均（STA）表明，在CLOSe+下，放电活动和LFP之间存在强烈的振荡耦合（图4a）。然而，STA分析可能会误导，因为CLOSe+下的LFP幅度显著增加，并且这本身就可以解释较大的STA。因此，我们使用相位锁定值（PLV）来量化神经元在LFP周期中如何一致地发出信号，无论幅度如何。PLV是通过将LFP滤波到1Hz带通滤波器计算出来的（图4b）。我们在CLOSe+下观察到一个与驱动振荡频率相关的相位依赖性PLV增加（图4c），这些增加对于记录的约三分之一的神经元具有统计学意义（图4d）。
图三：闭环刺激实验结果。
图四：使用相位锁定值（PLV）来量化神经元在LFP周期中如何一致地发出信号。
尽管使用了兴奋性光感受器，某些相位偏移（指定为CLOSe-）降低了周期触发的LFP振荡幅度相对于无刺激期（图5a）。为了更清楚地揭示这一点，我们对每个相位偏移期间的刺激期进行了原始LFP功率谱进行标准化（图5b），并将其与相应的无刺激期功率谱进行比较。图5c显示了在每个频率和每个相位条件下正常化的振荡功率。红色区域表示CLOSe+驱动正反馈振荡，而蓝色间隔区域表示CLOSe-相位偏移抑制LFP功率低于自发水平。在使用黄色光的对照实验中没有观察到这种调节（图5d），再次证明我们的结果是由光遗传学刺激介导的，而不是非特异性效应，如光电伪影或组织加热等。
我们还测试了通过植入的LED光导纤维传输的CLOSe。使用单个LED，可以显著调节LFP功率（图5e），尽管幅度较弱，与我们的商业光纤耦合系统中LED产生的光功率约为一半一致（扩展数据图2b）。图5f显示了在闭合回路滤波器带宽（0.8-1.2倍中心频率）附近调节功率的情况，在蓝光（通过光学纤维）和LED照射下（圆形-线性相关，n = 557刺激阶段，R = 00.90，P = 11 × 110 -10）以及LED照射下（n = 660，R = 00.86，P = 22 × 110 -10）具有统计学意义的影响，但对控制黄色光没有影响（n = 558，R = 00.13，P = 00.6）。我们在两个动物的三个半球上进行了实验，并观察到两种视紫红质的统计学意义上的相位依赖性功率调节。再次，我们可以改变增强和抑制频率的频率，通过改变滤波器频率。我们从任何单个相移的最大/最小LFP功率调节（原始数据，图5h顶部部分）和所有相移的正弦拟合（正弦拟合，图5h底部部分）量化了调节。正如脑片实验一样，平均调节（0.8-1.2倍滤波器频率）随着闭合回路滤波器频率的升高而逐渐减弱，但在三个数据集中的两个数据集中仍然观察到了40Hz的统计学意义上相位依赖性，对于Z-L数据集，最大调节在所有测试频率之间是可比的。
图五：在每个频率和每个相位条件下正常化的振荡功率。红色区域表示CLOSe+驱动正反馈振荡，而蓝色间隔区域表示CLOSe-相位偏移抑制LFP功率低于自发水平。
闭环系统体外调节诱导的癫痫样活动
在证明了相位偏移依赖的内源性振荡增强和抑制后，我们接下来研究CLOSe是否会影响药物诱导的类似癫痫病理状态。在我们的体外脑片模型中，持续给药4-氨基吡啶（4-AP）导致数小时内的间歇但重复的癫痫样事件，包括多个短暂的高频振荡放电爆发（约15-20Hz），如图6a所示。一旦这种活动模式稳定下来，我们就检查了闭环的影响。
图六：4-AP导致数小时内的间歇但重复的癫痫样事件。
我们将滤波器设置为振荡爆发的频率。CLOSe可以延长或缩短单个爆发的持续时间，具体取决于相位偏移（图7b左图）。图7b右图显示了不同CLOSe相位偏移相对于无刺激期对爆发持续时间的调节的对数图。在整个会话中，在整个会话中，CLOSe+ (0°相位偏移，平均值±标准误差，对数比爆发持续时间为1.00±±00.18)下，爆发持续时间翻倍，而CLOSe- (225°相位偏移，对数比爆发持续时间为-−0.44±±00.15)下减少了约四分之一。在八个相位偏移条件下进行的圆线相关性分析证实了这一点。
基于闭合回路相位偏移的爆发持续时间调节显著依赖于闭合回路相位偏移（n = 2221个癫痫爆发，R = 00.62，P = 111×110-16）。调节也表现为在类似癫痫事件期间LFP功率谱的相位依赖性增强和抑制（图6c）。在整个实验中，对来自十只小鼠的大脑切片的十个会话进行平均处理，癫痫爆发的相对持续时间在最大/最小log2比值为0.49±±00.13到-0.48±±00.11之间被调节，并且它显著地依赖于闭合回路相位偏移。
图七：CLOSe可以延长或缩短单个爆发的持续时间，具体取决于相位偏移。
CLOSe在体内调节癫痫样活动
在NHP的体内，向运动皮层注射4-AP可产生持续约20秒的延长癫痫发作事件，并且间隔时间规律（通常每分钟一次，大约一小时）。癫痫发作事件由初始范围为15-25Hz的振荡开始，随后是后惊厥放电。图8a显示了猴子Z（Chronos opsins）右半球的两个事件：第一个是在无刺激控制期间，第二个是在CLOSe递送期间，具有225°相移和明显的抑制性振荡放电。与体外数据不同的是，背景活动和癫痫发作的变异性阻碍了对每个事件的起始和终止的精确识别。因此，为了可视化在整个会话中CLOSe的影响，我们计算了LFP的自相关性。
图八：显示了猴子Z（Chronos opsins）右半球的两个事件。
在整个CLOSe和对照阶段的整个持续时间内，对在癫痫带（10-30 Hz）内的振幅包络进行分析。图9b中峰值宽度约为20秒揭示了癫痫爆发的广域时间结构，并且其高度和宽度的变化表明闭合环路刺激的调节作用。我们通过计算曲线下的面积（±20秒），量化了发作强度，尽管单个测量值受个体事件强度、持续时间和间隔的影响。此外，我们还计算了每个刺激条件的所有阶段的功率谱（图9c）。当与无刺激状态的谱相比较时，再次揭示了相依赖的特征模式（图9d）。最后，我们计算了总时间中癫痫发作幅度（定义为平滑、正弦化LFP）超过特定阈值的比例。而不是任意选择阈值，我们计算了所有可能的阈值值，直到未施加刺激条件下观察到的最大幅度。对于所有阈值值，在CLOSe+下花费的时间比例增加，在CLOSe-下减少（图7e）
图九：在整个CLOSe和对照阶段的整个持续时间内，对在癫痫带（10-30 Hz）内的振幅包络进行分析。
CLOSe稳定或不稳定异常网络动力学。癫痫活动通常被认为反映了大脑网络中兴奋性活动的增加。因此，我们观察到兴奋性刺激可以减少发作强度是反直觉的。为了研究CLOSe - 是否能够减弱类似发作事件，我们模拟了一个简单的Wilson-Cowan神经元群体模型，该模型以前曾应用于癫痫活动。该模型由两个相互连接的神经元群体（兴奋性和抑制性）组成，其活动在二维相空间中表示。
模型通过非线性动力学，瞬时状态随着时间的推移而演化，将相空间分为两个区域（图10a）。初始状态具有低兴奋活动的演变为一个稳定的固定点代表静止网络，而初始状态具有高兴奋活动则被吸引到一个极限周期代表癫痫样振荡。连接权重选择以产生与实验数据相似的振荡频率，并且向两个群体添加高斯噪声输入，允许在静止和发作区域之间进行概率转换。CLOSe被建模为对兴奋性群体的一个额外的兴奋性输入，取决于一个滞后LFP信号，该信号反映了两个群体活动的高通滤波组合。
从不同的闭环反馈条件开始的模型模拟定性地捕获了我们实验数据中的许多特征，包括相位偏移依赖的发作持续时间延长或缩短以及相关的谱功率调节。为了更好地理解这一点，我们研究了在不同CLOSe条件下发作极限周期的行为（图10c）。在没有输入噪声的情况下，仅刺激兴奋从未停止过发作，但随着相位偏移从CLOSe+到CLOSe-，极限周期经历周期加倍并变得越来越复杂，在相空间中波动于小周期和大周期之间。当较大的周期接近静止状态的边界时，有更高的概率将添加的噪声输入推入稳定固定点吸引子盆地。换句话说，相对于无刺激条件，我们的模型中发作爆发持续时间的变化可以解释为CLOSe+下极限周期稳定性增加及其在CLOSe-下的噪声敏感性的增加。
为了在我们的实验数据中寻找这种现象的证据，我们使用延迟嵌入来重建模拟和实际LFP数据的动力学。图10e、f和扩展数据图5显示了模拟和一个示例体外会话的延迟嵌入轨迹的二维和三维投影。模型和实验数据之间存在明显的定性相似；闭环刺激的一些阶段与简单的平面周期相关联，而其他阶段则产生复杂的扭曲轨迹。我们量化了这些轨迹的两个指标：（1）半径的变异性系数（CoV）和（2）近似熵，这是一种信息论复杂性的度量，在以前已被应用于癫痫发作数据16。对于模拟和实验数据，这两个指标都显示出相位偏移依赖的调节，其中相对无刺激而言，较低/较高的轨迹变异性和熵分别与CLOSe+/CLOSe–相关。对于体外和体内数据集（图8i），CoV和近似熵轨迹与癫痫持续时间和严重程度呈反向相关（所有情况下P < 0.05），这表明增强和抑制癫痫样活动与闭环反馈有关，该反馈分别稳定和不稳定化了癫痫发作循环。
图十：模型仿真结果。
讨论
我们的结果表明，兴奋性刺激对神经回路的影响取决于其相对于持续振荡的瞬时相位何时被施加，并且可以通过闭合环路的方式进行控制，因为光遗传学不会阻止同时记录LFP。然而，我们感兴趣的是，是否也可以通过开环方式输送适当的刺激序列来实现抑制。因此，我们使用计算模型确定了能够衰减癫痫爆发的闭合环路刺激模式，并在随后的模拟运行中重播这些模式。但是，相同的刺激模式通过开环方式输送却无法衰减癫痫发作，即使该模式是在癫痫周期的相同阶段开始（扩展数据图6a），这是因为每个运行之间引入的噪声导致了微妙的不同。这种对噪声的敏感性是我们的模型所表现出的复杂动力学特征之一，这意味着要确定可以抑制癫痫发作的适当刺激模式是不可能预先确定的，只能通过闭合环路刺激来输送。
