约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组，一篇Nat. Catal.一篇JACS！

光酶催化作为化学催化与生物催化交叉融合的前沿研究方向，在过去十年间取得了令人瞩目的进展。特别是依赖有机辅因子的酶，如含黄素辅因子（FAD/FMN）、磷酸吡哆醛辅因子（PLP）、烟酰胺辅因子（NAD(P)H）以及硫胺素辅因子（ThDP）的酶，在过去五年内几乎主导了光酶催化领域的所有突破性成果。这些催化体系成功将许多此前未曾在酶催化中实现的化学转化过程引入其中，为生物催化研究带来了全新的可能性。然而，光/金属协同催化这一重要的光催化反应模式在生物催化领域的发展却显著滞后。这与其在合成化学中作为主导催化策略的核心地位形成了鲜明对比。这种对比不仅揭示了当前生物催化领域的局限性，也表明这一方向蕴含着巨大的研究潜力。在此背景下，将光/金属协同催化的核心原理与生物催化相结合，能够为光酶催化的研究与应用开辟全新的可能性。这种融合策略可以利用光催化剂高效生成活性自由基物种，同时借助金属酶对化学选择性和立体选择性的精准调控，构建高效且高度可调的催化体系。通过这一跨学科的创新探索，光酶催化有望进一步拓展其在生物化学与合成科学中的应用边界。    

图1

约翰霍普金斯大学黄雄怡课题组致力于探索合成化学与合成生物学的跨学科融合，尤其在非血红素铁酶的功能化改造领域取得了重要突破。课题组的研究旨在通过创新策略，将化学催化的多样性与生物催化的高选择性结合，推动新型催化体系的发展。课题组主要聚焦于非天然化学反应在金属酶催化体系中的引入。通过定向进化手段，他们成功重塑了非血红素铁酶的催化机制，使其能够催化一系列天然酶无法完成的反应，从而显著拓展了金属酶的催化功能（Science 2022, 376, 869-874 和 Nature Synthesis 2024, 3, 958-966）。这些工作展示了金属酶在催化科学中的巨大潜力。基于这一研究基础，黄雄怡课题组近期进一步创新，设计并实现了一种结合光催化与金属酶催化的新型光/金属酶协同催化体系（图 1）。这一体系成功将不对称金属光氧化还原催化的核心理念引入到酶催化中，开辟了生物催化研究的新方向。通过这一研究，课题组首次证明了光催化剂与非血红素铁酶在催化中的协同潜力。这种光/金属酶协同催化体系不仅能够实现高度对映选择性的自由基转化，还为未来开发更加复杂、多样化的催化反应提供了实践框架。    

本研究探索了绿光照射下光催化剂伊红 Y (Eosin Y) 与 4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶 (HPPD) 的协同作用，成功实现了氧化还原活性酯的对映选择性脱羧叠氮化和硫氰酸化反应。在研究的起始阶段，作者将野生型 HPPD 与光催化剂伊红 Y 结合，测试其对模型氧化还原活性酯 1-NHPI 的催化效果。结果显示，该体系能够以 21% 的收率、TTN = 140 和 er = 70:30 转化生成目标产物。为了提高催化效率与对映选择性，研究者对靠近底物结合区域和活性位点的 7 个氨基酸残基 进行了定点饱和突变 (SSM) 筛选（图 2）。筛选结果表明，SavHPPD V189A 突变体 显著增强了催化性能，将 TTN 提高至 240，并将对映选择性优化至 er = 73:27。这一改进可能与活性位点空间结构的调整有关，从而提升了底物结合效率和自由基捕获能力。基于 SavHPPD V189A，进一步的突变筛选发现 S230Y 突变 对提升对映选择性至关重要。研究推测，S230Y 突变通过在活性位点内创造更疏水的微环境，借助疏水相互作用或 π-π 相互作用，引导底物自由基更靠近 Fe(III)-N₃ 中间体，从而显著促进了 C‒N₃ 键 的高效形成。优化后，目标产物的对映选择性 (ee%) 提升至初始值的两倍。在此基础上，通过进一步的 SSM 筛选，研究者最终构建了 四重突变体 SavHPPD C188A/V189A/S230Y/Q255A（简称 SavHPPD-PC）。这一突变体展现了卓越的催化性能，能够以 TTN = 200 和 er = 94:6 的高选择性生成目标产物。

图2   

图3

在确定了最佳反应条件与最优突变体后，研究者系统地评估了光生物催化反应的底物耐受性（图 3）。结果显示，苯环上带有卤素、甲基和甲氧基取代基的底物表现出良好的耐受性，能够较高效地进行脱羧叠氮化反应。然而，含有异丙基和三氟甲基取代基的底物则未发生反应，这可能是由于这些较大的取代基与活性位点中的氨基酸残基之间产生了显著的立体位阻。此外，带有邻位氰基的底物同样无法反应，表明取代基的电子效应对反应过程也具有显著影响。对于一级、二级和三级烷基酸的 NHPI 酯，尽管反应的脱羧速率较慢，以及所生成的 C(sp³) 自由基的稳定性明显低于苄基自由基，这些底物依然能够被有效地转化为叠氮化产物。当叠氮被替换为胺、醇、卤素或拟卤素等其他亲核官能团时，反应未能进行。这种选择性可能是由于这些官能团无法与 SavHPPD 的铁中心有效结合，导致自由基捕获中间体无法成功生成。然而，当叠氮化物被替换为硫氰酸盐时，该体系能够以 TTN = 45~114 和 er = 56:44 ~ 78:22 生成对应的脱羧硫氰化产物。尽管产物的对映选择性尚不理想，但这标志着生物催化自由基 C(sp³)‒SCN 键形成的首次成功，凸显了光生物催化策略在开发新型金属酶自由基反应中的广阔潜力。    

图4

作者与卡内基梅隆大学郭以嵩课题组及西班牙赫罗纳大学 Marc Garcia-Borràs 课题组合作，深入探讨了反应机理。研究发现，随着产物生成，底物始终保持为消旋体，表明酶能够同时结合 (R)- 和 (S)-1-NHPI，并有效催化其转化为自由基中间体（图 4a）。这一结论通过分子动力学模拟 (MD) 得到了验证。电子顺磁共振 (EPR) 实验进一步确认了 Fe(III) 中间体的形成（图 4b）。在无 1-NHPI 时，光照下 Fe(III) 的生成极少，而加入 1-NHPI 后，Fe(III) 积累显著增加。推测其原因可能是：(1) 初始单电子转移 (SET) 发生于 1-NHPI 和激发态伊红 Y 之间；或 (2) Fe(II) 与激发态伊红 Y 发生 SET 后，缺乏 1-NHPI 时发生快速反向电子转移，淬灭了还原态伊红 Y，从而限制 Fe(III) 的生成。斯特恩-沃尔默猝灭实验（图 4c）进一步揭示了 SET 过程。实验表明，1-NHPI 单独存在时不会猝灭伊红 Y，而 Fe(II) 的猝灭效率也较低。然而，在酶存在下，猝灭效率提升了 4 倍以上，表明酶通过缩短伊红 Y 和铁中心的距离促进了 SET。分子动力学模拟与分子对接分析显示，伊红 Y 可能结合于 SavHPPD-PC 的多个位点，这些位点富含赖氨酸和精氨酸残基，并位于铁中心 20 Å 以内（图 4d）。这种结合模式与伊红 Y 借助极性表面残基与蛋白质结合的特性一致，支持了铁中心与伊红 Y 间长程电子转移的可能性。综合实验与理论分析，研究结果更支持图5中的催化循环 2 模式：激发态伊红 Y 首先将 Fe(II) 氧化为 Fe(III)，随后通过第二次 SET 激活 NHPI 酯完成反应。尽管无法完全排除催化循环 1 的可能性，但催化循环 2 的机理更符合实验观察。    

图5