继 RNA 干扰（RNAi）和 CRISPR 之后，性能更强、配置更简洁的第三代 RNA 引导的基因编辑技术要来了。近期，来自加州大学伯克利分校 Patrick Hsu 课题组在 Nature 发表了两篇研究（图 1），在没有CRISPR 编辑器的条件下，通过研究插入序列 (IS) 与靶标和供体 DNA 相互作用的机制和结构特性，在自主转座因子中发现了一种基因组编辑工具 IS110 重组酶，IS110 家族元件编码一种重组酶和一种非编码桥 RNA（Bridge RNA），这个桥 RNA 比常规重组酶更易修饰，现有基因编辑技术需利用更复杂的效应蛋白-DNA 结合位点，而 IS110 桥接重组系统使用单一而紧凑的 RNA 引导重组酶直接重组 DNA 且不产生需修复的断裂。据悉，这两篇论文的通讯作者 Patrick Hsu 是 CRISPR 基因编辑先驱张锋院士的第一届研究生。
图 1 论文题图（来源 Nature）
1. IS110 桥系统的功能
IS110 有什么来头？插入序列（IS）元件是在原核基因组中发现的最简单的自主转座元件，IS 元素在细菌和古细菌中非常丰富，IS 被归类为 28 个家族。IS110 家族编码一种独特的重组酶，该重组酶包含一个与解开霍利迪连接（即同源重组过程中形成的中间 DNA 结构）的酶同源的结构域。此外，从基因组中切除后，IS110 元件会形成环状中间体，重新组成转录与 CRISPR RNA 相似的非编码 RNA (ncRNA) 的启动子，这表明这些 ncRNA 可以像向导 RNA 一样靶向 IS 重新插入。
非编码 RNA 起什么作用？为了进一步研究这些 ncRNA 在 IS110 活性中的作用，研究者首先关注了 IS110 家族的成员 IS621。作者使用小 RNA 测序来确认 ncRNA 是从大肠杆菌中的 IS621 质粒转录的。接下来，通过亲和力测量证明体外从 IS621 转录的 ncRNA 与 IS621 重组酶紧密结合。进一步分析显示 ncRNA 区域与靶标（基因组插入位点）和供体（IS621 质粒）DNA 之间存在显著的序列共变，表明 ncRNA 区域与靶标和供体 DNA 碱基配对。体外重组实验表明所有四种成分，即结合了转录的 ncRNA、IS621 重组酶、靶标和供体 DNA，都是形成预期重组产物所必需的。
该实验还表明，ncRNA-重组酶复合物与供体和靶标 DNA 结合，因此作者将这些命名为「桥 RNA」。这个 RNA 桥具有两个不同的结合环，分别识别 IS110 DNA 供体及其基因组插入靶位点。通过直接碱基配对相互作用连接供体和靶 DNA 分子，双特异性桥接 RNA 促进 IS110 重组酶的 DNA 重组。桥接 RNA 的每个结合环都可以独立地重新编辑以结合和重组不同的 DNA 序列。
图 2：IS110 移动遗传元件表达与其编码的重组酶结合的 ncRNA（图源：[1]）
IS110 系统是否可以被设计成基因组编辑工具？研究者使用基于质粒的系统来量化重组率，发现桥接 RNA 可以高比率（59.5%）引导七种不同靶序列的重组。此外，桥接 RNA 可以高效引导切除和倒位。
图 3：IS621 靶位点是可重新编辑的并由桥 RNA 指定（图源：[1]）
为了测试该系统的错配耐受性，团队开发了基于质粒的高通量系统来筛选重组，在改变参与靶标识别的九个核心桥接 RNA 位置的同时测量了重组率，发现桥接 RNA 引导的重组错配耐受性较低，并且在每个位点都是可编辑的，所有供体序列都表现出高重组率（95%）。
研究者还测试了桥接 RNA 在大肠杆菌基因组内指导重组的效率，发现野生型 IS621 供体序列和桥接 RNA 产生了 173 个独特的插入，其中 129 个与桥接 RNA 编码的靶序列相匹配。为了确定全基因组特异性，对桥接 RNA 进行了编辑，使其靶向大肠杆菌基因组中仅出现一次的位点。研究表明该系统表现出特异性，51.6% 的插入都位于预期位点，当靶序列从 4 bp 延长到 7 bp 时，比例提高到 94%。后续研究利用低温电子显微镜的结构解析支持了这些发现。
2. IS110 复合体的结构
整体结构和组织形式是怎样的？IS621 重组酶由 RuvC 结构域、双链 α 螺旋卷曲螺旋结构域和 Tnp 结构域组成。RuvC 结构域采用 RNase H 折叠，由四个 α 螺旋两侧的五链 β 折叠组成，活性位点由 DEDD 基序构成。Tnp 结构域包含七个 α 螺旋，保守的丝氨酸残基 S241 位于螺旋 α3 和 α4 之间的环区。
图 4：IS621 重组酶复合体结构（图源：[1]）
典型的 RuvC 样结构域不需要其他结构域来发挥催化活性，而 IS110 重组酶的 RuvC 结构域与其 Tnp 结构域一起发挥作用，IS110 特异性 DEDD 基序中的第三个残基（IS621 中的 D102）与 IS110 特异性 Tnp 结构域的 S241 形成复合活性位点。
桥接 RNA 靶标结合环（TBL）包含两个引导片段，左靶标引导链（LTG）和右靶标引导链（RTG），供体结合环（DBL）也由左供体引导链（LDG）和右供体引导链（RDG）组成。TBL 中的 LTG 和 RTG 以及 DBL 中的 LDG 和 RDG 通过碱基配对分别识别 tDNA 和 dDNA 的底部链和顶部链。桥接 RNA 通过切割目标和供体 DNA 的上部链，创建霍利迪连接中间体并通过切割下链来解开，实现 IS110 重组酶的编辑特异性。
图 5 bRNA 和 tDNA 以及 dDNA 之间碱基配对（图源：[1]）
复合体作用机制是怎样的？研究报告了 IS110 重组酶与其桥 RNA、目标 DNA 和供体 DNA 在重组反应周期的三个不同阶段的冷冻电镜结构。对这三种结构的比较揭示了以下过程：1）目标和供体 DNA 的顶端链在复合活性位点处被切割，形成共价 5'-磷酸丝氨酸中间体；2）切割的 DNA 链交换并重新连接形成 Holliday junction 中间体；3）随后通过切割底端链来解离中间体。
图 6 IS621 复合体的结合界面和组建机制（图源：[1]）
图 7 链交换机制（图源：[1]）
总的来说，两项研究确定了 IS110 元素在基因组内转移的机制。双特异性桥接 RNA 对靶标和供体识别进行模块化重编辑，可协调不同 DNA 序列对之间的重组，实现了特异性插入、切除和倒置，从而可以操纵大规模 DNA 序列和整个基因组。随着进一步的探索和开发，预计桥接重组机制将催生出第三代可编辑 RNA 引导工具，超越 RNA 干扰和 CRISPR 机制，开辟基因组设计新领域。
