《应用化学》第41卷第5期封面文章：银染高尔基染色法用于神经元完整结构成像
文摘
科学
2024-07-10 09:00
吉林
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题目：银染高尔基染色法用于神经元完整结构成像
作者：周峰, 蔡小青*, 汤乔伟, 诸颖, 王丽华, 胡钧
文章链接：http://yyhx.ciac.jl.cn/CN/10.19894/j.issn.1000-0518.230305#
DOI：10.19894/j.issn.1000-0518.230305
高尔基染色方法是一种含有重金属铬酸盐-硝酸银的脑组织染色方法，自被开发100多年来，一直是神经元形态学分析最常用的方法，在光学显微镜的观察下能观察到神经元树突及树突棘等结构。但是高尔基染色方法在染色过程中存在随机性、染色效果质量不佳和染色时间长等一系列问题，使得成像的神经元结构存在不完整以及成像背景噪点高等问题。自1873年以来，研究人员已经尝试通过各种手段来对高尔基染色方法做出优化，其中包括调节pH值、使用不同醛类有机化合物固定脑组织、使用Triton X-100促进重铬酸钾和硝酸银的渗透、使用CUBIC或者CLARITY手段对脑组织进行透明化处理、使用微波、真空和温度变化来影响染色液在大脑组织中的渗透。
目前，高尔基染色方法主要有3种变体： 快速高尔基染色方法（Rapid-Golgi）、醛基高尔基染色方法（Golgi-Kopsch）以及高尔基-考克斯（Golgi-Cox）方法。根据其中所用的主要重金属不同，其中前2种方法又可被称为“银染”，后一种染色方法可被称为“汞染”，与醛基高尔基染色方法相比，其中快速高尔基染色方法和高尔基-考克斯染色方法由于其成分中分别含有锇酸和汞剧毒危险性化学物质，在实验操作中更容易对人体产生危害。对于长期固定的脑组织样品，基于醛基固定的银染高尔基染色方法是一种非常有效的染色方法，可以实现对大鼠的梨状皮层、丘脑和尾状壳核等脑区神经细胞的观察，除此之外，也可以实现对猴脑海马的神经细胞进行染色和观察。目前，银染高尔基染色方法还存在染色过程中容易产生黑色杂质沉淀，无法完整可视化神经元的形态结构等问题。
高尔基染色是神经元树突和树突棘可视化的经典方法，目前仍被广泛用于神经元形态可视化。银高尔基染色目前存在易产生黑色沉淀、染色神经元形态结构不完整等问题。对重铬酸钾（K2Cr2O7）和硝酸银（AgNO3）如何影响银染高尔基染色方法的染色效果进行了研究，通过研究染色液组成成分重铬酸钾、硝酸银质量浓度变化和组分的不同作用方式，实现了对银染高尔基染色方法的优化。结果表明，35mg/mL多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）和20mg/mL K2Cr2O7混合液染色效果要明显优于20mg/mL K2Cr2O7单独染色效果，在K2Cr2O7的质量浓度优化过程中，80mg/mL K2Cr2O7的染色效果最佳，35mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合溶液和80mg/mL K2Cr2O7最佳染色时长比为3∶1，染色过程中AgNO3的最佳质量浓度为10mg/mL，在最终的染色液组成成分以及作用方式中40mg/mL PFA固定2d、35mg/mL PFA和20mg/mL K2Cr2O7混合溶液处理3d、80mg/mL K2Cr2O7处理1d和10mg/mL AgNO3处理5d对脑组织神经元形态的可视化具有最佳效果。优化后的银染高尔基染色方法可实现对神经元的完整形态结构染色，同时在染色过程也将产生更少的成像杂质沉淀噪点。该工作将提供一种新的高尔基改良染色方法，实现神经元完整形态结构的染色，有望为研究脑神经元结构变化与脑疾病之间的关系提供新的染色方法。
图1 PFA与K2Cr2O7混合液染色不同时长后的光学显微镜成像结果（A） 20 mg/mL K2Cr2O7溶液染色2d，（B） 35mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色2d，（C） 35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液染色4d，（D） 35 mg/mL PFA与20 mg/mL K2Cr2O7混合液染色5d，（E） 35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液染色6d，（F） 35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液染色8d， （G） 神经元形态Sholl分析。红色椭圆虚线框：黑色沉淀；蓝色椭圆虚线框：有方向性的神经纤维；红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构。
要点：已有研究工作报道，在进行高尔基染色前，使用PFA处理组织，将会增加染色神经胶质细胞的数量，K2Cr2O7对组织具有铬化作用。为了验证将PFA和K2Cr2O7进行混合染色是否会对染色效果产生积极效果，参考文献，选择35mg/mL PFA与20 mg/mLK2Cr2O7混合液作用于脑组织，另取20mg/mL K2Cr2O7溶液作用于脑组织作为对比，结果如图1所示。仅有K2Cr2O7溶液作用2 d时，只能在海马组织表面观察到不成形态的黑色沉淀（图1A），无法对神经元形态进行有效浸染以及进一步的分析。当使用PFA与K2Cr2O7混合液进行染色2d时，则可以在海马组织表面上观察到大量具有方向性的神经纤维的存在（图1B）。结果说明35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液比20mg/mL K2Cr2O7溶液染色对神经纤维具有更好的染色效果，产生这种结果的可能原因是，PFA的存在促进了K2Cr2O7在组织中的氧化还原作用，使得组织对K2Cr2O7的亲和更强，从而有利于后续与AgNO3进行沉淀反应。更进一步地，探索了不同时长作用下该混合液染色的效果，发现染色时长为4d时，通过光学显微镜可以观察出海马组织的神经元形态，能清晰地分辨出神经元的胞体和树突结构（图1C）。随着染色时间的延长，染色效果并没有得到很好地提升，在染色时长为5d时，大部分的神经元树突结构没有被染色出来，且在组织表面可观察到大块的黑色沉淀（图1D），当染色时长为6d时，组织表面被染色可分辨的神经元更少，组织表面出现大部分的黑色沉淀，神经元形态变得难以区分，神经元树突的结构变得不太完整（图1E），当染色时长为8d时，组织表面大部分是黑色沉淀，被染色的神经元结构也是缠结在一起，这将对分析单个完整神经元结构带来困难（图1F）。将成像结果进一步进行sholl分析，结果显示染色时长为4d时，神经元形态结构最完整，复杂程度更高，单个神经纤维的长度也更长（图1H）。基于上述实验结果，选择35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液染色4 d继续对银染高尔基染色方法进行优化来实现神经元完整结构的可视化。
K2Cr2O7质量浓度对
完整神经纤维可视化的影响
图2 不同质量浓度K2Cr2O7染色后的光学显微镜成像图。K2Cr2O7质量浓度分别为（A） 20mg/mL、（B） 40mg/mL、（C） 60mg/mL和（D） 80mg/mL，（E） 神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框： 黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框： 有方向性的神经纤维，红色矩形虚线框： 具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框： 血管结构要点：K2Cr2O7具有较强氧化的性质，高尔基染色过程涉及多个氧化还原过程，所以不同K2Cr2O7的质量浓度可能会影响相关的氧化还原反应，从而影响最终的染色效果。在这里，研究了K2Cr2O7质量浓度的改变是否会影响染色液对完整神经纤维可视化。选择了不同质量浓度（20、40、60和80mg/mL）的K2Cr2O7对脑组织进行染色，结果如图2所示。当质量浓度为20mg/mL时，可以观察到组织表面有大量短的神经纤维，同时也能观察到一些黑色沉淀沉积在组织表面（图2A）；在质量浓度为40mg/mL时，可以观察到有大量的黑色沉淀覆盖在胞体上，并且这些沉淀影响了胞体的成像观察和神经元结构完整的成像，在组织的表面还能观察到大量血管的存在，这将会影响后续单个神经元形态的分析（图2B）；当质量浓度为60mg/mL时，神经元形态清晰可见，胞体和树突结构清晰，但表面存在较多的黑色沉淀背景（图2C）；当质量浓度为80mg/mL时，神经元形态同样也可以清晰可见，胞体和树突结构清晰，与前3组结果相比，组织表面的黑色沉淀较少，背景更干净，神经纤维更长（图2D）。sholl分析结果显示，当K2Cr2O7质量浓度为80mg/mL时，脑组织中的神经元形态更复杂，神经纤维长度也更长（图2E）。以上结果说明，当K2Cr2O7的质量浓度低于80mg/mL时，无法对组织内的神经元结构进行完整染色和成像，当质量浓度不低于80mg/mL时，能够实现对组织内神经元结构的完整染色和成像，神经元胞体和树突结构清晰可见，此时组织表面的沉淀也更少。产生这些实验结果的原因可能是随着K2Cr2O7质量浓度的升高，K2Cr2O7对组织的铬化作用更强以及与组织内的还原性物质发生了更充分的氧化还原反应，从而有利于后续与AgNO3进行沉淀反应，对组织进行更高效的着色。上述实验结果表明，在进行银染高尔基染色时，K2Cr2O7的最佳质量浓度为80mg/mL。
PFA与K2Cr2O7混合溶液和K2Cr2O7溶液作用时间比例对神经元完整结构可视化的影响图3 不同染色时长比例染色后的光学显微镜成像图PFA与K2Cr2O7混合溶液和K2Cr2O7溶液染色时长比例分别为0∶4（A）、1∶3（B）、2∶2（C）、3∶1（D）和4∶0（E）， （F）神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框：黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框：不完整的神经元结构，红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框：血管结构要点：基于上一步的实验结果，在80mg/mL K2Cr2O7下，可以获得良好的染色效果，假设PFA与K2Cr2O7混合液在高效固定组织的同时，还能促进K2Cr2O7与组织内还原性物质发生反应，在总的作用时间（4d）不变的情况下，对PFA与K2Cr2O7混合液染色时长和80mg/mL K2Cr2O7染色时长的比例进行了优化，探究后续加入高质量浓度的K2Cr2O7是否也能对染色发挥促进作用。在这里设置了5组不同的染色时长比例（0∶4、1∶3、2∶2、3∶1和4∶0），通过光学显微镜对染色的脑组织进行明场成像，结果如图3所示。当染色时长比例为0∶4时，在组织表面不能观察到完整的神经元结构，可以观察到神经纤维，但是组织表面还存在血管结构，且组织表面的大量黑色沉淀将会影响成像质量（图3A）；当染色时长比例为1∶3时，在表面上可以观察到大量的血管结构，只有少量不完整的神经元结构被可视化（图3B）；当染色时长比例为2∶2时，在成像结果的右上角可以观察到少量完整的神经元结构，但是在中间及左下角，可以观察到大部分不完整的神经元结构，其中大部分是神经纤维结构（图3C）；当染色时长比例为3∶1时，可以观察到大量完整的神经元结构，神经元胞体和树突结构清晰可见（图3D）；当染色时长比例为4∶0时，则是观察到大量的神经元胞体结构，神经元树突结构并没有很好的被可视化（图3E）。sholl分析结果显示，当PFA和K2Cr2O7混合液和K2Cr2O7溶液染色时长比例为3∶1时，神经元形态更完整，神经纤维长度更长（图3F）。由上述实验结果可知，当35mg/mL PFA和20mg/mL K2Cr2O7混合液和80mg/mL K2Cr2O7溶液染色时长比例为3∶1时，此时使用该银染高尔基染色方法可以获得良好的染色结果。与探索K2Cr2O7质量浓度对染色效果的影响实验中获得的实验结果相比，此时获得神经元结构的完整性更好，神经元树突复杂性更高。图4 不同质量浓度AgNO3染色后的光学显微镜成像图。AgNO3质量浓度分别为5（A）、7.5（B）、10（C）、12.5（D）、15（E）和20mg/mL（F），染色后的光学显微镜成像图， （G）神经元形态Sholl分析，红色椭圆虚线框：黑色沉淀，蓝色椭圆虚线框：不完整的神经元结构，红色矩形虚线框：具有胞体和树突结构的神经元结构，蓝色矩形虚线框：血管结构要点：在染色过程中发生的化学反应，AgNO3的质量浓度除了影响铬酸银晶体（Ag2CrO4）形成从而影响最终组织中神经元结构的可视化，还会影响沉淀杂质在组织表面的产生情况。为进一步优化AgNO3在组织染色过程的能力，在保持35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合溶液和80mg/mL K2Cr2O7染色时长比例为3∶1的条件下，选择了不同质量浓度（5、7.5、10、12.5、15和20mg/mL）的AgNO3对脑组织进行染色，通过光学显微镜对染色的脑组织进行明场成像，结果如图4所示。当AgNO3的质量浓度为5mg/mL时，组织表面只能观察到呈弧形海马区的大致解剖形态结构，无法从组织上识别出神经元形态结构（图4A）；当AgNO3的质量浓度为7.5mg/mL时，可以在组织表面观察到一些清晰、稀疏的神经元结构，但这些大部分是不完整的结构（图4B）；当AgNO3的质量浓度为10mg/mL时，可以在组织表面上观察到完整的神经元形态结构，神经元胞体和树突结构清晰可见，且其中的神经元形态走向清晰，可用于神经元形态结构分析（图4C）；当AgNO3的质量浓度升高为12.5mg/mL时，则在组织表面出现更多的黑色沉淀，以及产生一些血管结构，这将对成像结果产生背景干扰，而且神经元的结构完整性不如质量浓度为10mg/mL时的染色结果（图4D）；当AgNO3的质量浓度为15mg/mL时，在成像结果的左右两侧均可以观察到血管的存在，只有在中间部分才观察到少量不完整的的神经元结构（图4E）；当AgNO3的质量浓度为20mg/mL时，在组织表面观察到大量的黑色沉淀，其沉淀影响的染色效果比质量浓度为12.5mg/mL时还严重，大量的沉淀覆盖在神经元结构上，严重影响了对神经元结构的观察以及后续的结构分析（图4F）。sholl分析结果显示，当AgNO3质量浓度为10mg/mL时，其染色的脑组织神经元形态完整性和神经元复杂程度更好，神经纤维长度也更长（图4G）。产生上述结果的因素可能是由于在反应过程中10mg/mL AgNO3更高效的产生铬酸银晶体，便于浸入组织，实现对组织的良好染色。上述实验结果表明，在进行银染高尔基染色时，AgNO3的最佳染色质量浓度为10mg/mL。本文研究了高尔基染色液组成成分K2Cr2O7和AgNO3质量浓度变化和组分的不同作用方式对脑组织神经元形态染色可视化的影响。实验结果表明，80mg/mL K2Cr2O7和10mg/mL AgNO3的染色效果最佳，35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液的染色效果要明显优于仅有20mg/mL K2Cr2O7溶液的染色效果，35mg/mL PFA与20mg/mL K2Cr2O7混合液及80mg/mL K2Cr2O7溶液的最佳染色时长比为3∶1。基于银染高尔基染色方法优化获得的染色和成像结果可以较好地呈现神经元的完整形态结构，该工作有望为研究脑神经元结构变化与脑疾病之间的关系提供新的染色方法。
