文章信息：
标题：Sirt6 ablation in the liver causes fatty liver that increases cancer risky by upregulating Serpina12
其他：EMBO Rep. 2024 Mar;25(3):1361-1386. doi: 10.1038/s44319-024-00071-3. Epub 2024 Feb 8
数据编号：PRJNA1037717（chip-seq）
文章背景简单了解
非酒精性脂肪肝病是一种慢性肝脏异常，具有高度的变异性，并在晚期可能导致肝癌。在肝脏中消融SIRT6会导致脂肪肝病，然而，SIRT6缺乏的潜在机制，特别是与非酒精性脂肪肝病（NAFLD）下游调控子的关系，仍然是个谜。
在这里，作者确定了Serpina12是受Sirt6调控的关键基因，它在能量平衡中发挥着至关重要的作用。具体来说，Sirt6通过在其启动子区域的组蛋白去乙酰化来抑制Serpina12的表达，之后转录因子Cebpα结合并调节其表达。Sirt6的缺乏导致肝细胞中Serpina12的表达增加，这增强了胰岛素信号并促进了脂质积累。重要的是，通过CRISPR-Cas9介导的Serpina12基因敲除在肝脏中改善了由Sirt6消融引起的脂肪肝病。最终，作者证明了Sirt6在肝脏中起到肿瘤抑制基因的作用，因此，肝脏中Sirt6的缺失不仅会导致肿瘤的自发形成，还会在DEN处理或肥胖条件下增强肿瘤的发生。
实验设计以及相关组学
chip-seq样本：
Then the samples were divided into five parts. One part is for Input, and the other four parts are for antibodies against IgG, H3K9ac, and H3K56ac (Normal Rabbit IgG -CST 2729 s; Histone H3 (acetyl K9)-Abcam ab4441; H3K56ac Invitrogen PA5-40101).
ChIP-seq原理
DNA缠绕在组蛋白上形成核小体，这些核小体折叠并压缩形成染色质。在DNA复制和转录过程中，某些染色质区域会被打开，使调控机制能够结合到暴露出来的DNA结合位点。染色质免疫沉淀后进行测序（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP-seq）：一种用于检测和表征蛋白质-DNA相互作用的方法，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。
将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
Sirt6-LKO mice
Sirt6-LKO mice（Sirt6肝特异性敲除小鼠）是一种基因工程小鼠模型，它们在肝脏中特异性敲除了Sirt6基因。
Sirt6是Sirtuin家族成员之一，属于III类组蛋白去乙酰化酶（HDAC），使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作为辅因子。
SIRT6在肝脏中扮演着重要的角色，包括调节肝细胞中的甘油三酯、胆固醇和低密度脂蛋白（LDL）的稳态。
Sirt6-LKO小鼠在西方饮食诱导下更容易发展成脂肪肝病，表现为血清和肝脏中的甘油二酯和甘油三酯水平升高。
此外，SIRT6还通过去乙酰化作用抑制多个关键的转录因子，包括肝脏X受体（LXR）、碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）、甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）和X盒结合蛋白1（XBP1）。
Sirt6-LKO小鼠在正常饮食和高脂饮食下都会发展出肝脂肪变性，而且在5-6个月大时，近一半的Sirt6-LKO小鼠会发展出脂肪肝，到13个月大时，90%的LKO小鼠会有脂肪肝。
SIRT6还通过与核心生物钟组分的相互作用，以昼夜节律的方式调节SREBP1的转录活性。
Sirt6-LKO小鼠在多种肝脏损伤模型中表现出更高的敏感性，包括酒精诱导的肝损伤、高脂饮食诱导的氧化应激和内质网应激。
SIRT6在保护肝脏免受各种损伤方面发挥着重要作用，包括酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和肝纤维化。
Sirt6-LKO小鼠模型为研究SIRT6在肝脏代谢和疾病中的作用提供了重要的工具。
Sirt6co/co (Sirt6 Floxed) 小鼠
Sirt6co/co (Sirt6 Floxed) 是指含有Sirt6基因的loxP位点插入的杂合小鼠模型。在这些小鼠中，Sirt6基因的两个等位基因中的一个被loxP位点所包围，这种设计允许通过与Cre重组酶的特定组合来敲除Sirt6基因。
"Floxed"一词来源于"floxed"，意味着基因两侧被loxP位点所"flanked"（包围）。
这种基因型的动物模型在遗传学研究中非常有用，因为它们提供了一种条件性敲除基因的方法，可以通过引入Cre重组酶在特定的组织或发育阶段敲除目标基因。
Sirt6co/co小鼠模型在研究Sirt6基因功能时非常有价值，因为它们可以通过与特定启动子控制的Cre小鼠杂交，实现在特定组织或细胞类型中特异性敲除Sirt6基因。例如，通过与白蛋白启动子（Alb-Cre）控制的Cre小鼠杂交，可以生成肝脏特异性的Sirt6敲除小鼠（Sirt6-HepKO），用于研究Sirt6在肝脏中的功能。这种模型对于理解Sirt6在不同生理和病理过程中的作用至关重要，包括衰老、代谢调控、DNA修复、基因组稳定性以及与多种疾病相关的研究。
ob/ob mutant mice
ob/ob 突变小鼠是一种由于瘦素基因（leptin gene）突变导致的肥胖模型。这种小鼠的主要特征包括：
肥胖和高血糖：ob/ob 小鼠因瘦素基因突变，导致瘦素合成分泌障碍，从而引起肥胖和高血糖症状。
食欲过盛：这些小鼠表现出食欲过盛，即过量进食，导致非常肥胖，是一种2型糖尿病模型。
胰岛素抵抗：ob/ob 小鼠表现出胰岛素抵抗，尽管胰岛素水平提高，但仍会发展为高血糖。
生育能力受损：纯合突变的ob/ob小鼠无生育能力，因此必须通过杂合子交配来维持这个基因品系。
代谢失调：ob/ob 小鼠在6至9周龄时有中度的高血糖，但12至16周后自发消失。它们在8至9月龄时体重增加到最大值，约为70克，表现出多种代谢失调，包括脂肪形成增加和脂肪分解减少。
糖尿病样症状：ob/ob 小鼠表现出糖尿病样的高血糖综合症，糖耐量不良，血浆胰岛素升高等症状。
脂肪细胞变化：ob/ob 小鼠的肥胖是由于脂肪细胞数目增多和体积增加的结果，被称为肥大性-增生性肥胖症。
能量消耗和活动度降低：这些小鼠能量消耗和活动度降低，体温下降。
ob/ob 小鼠由于其独特的生理和代谢特征，常被用作研究肥胖、2型糖尿病以及相关代谢性疾病的模型。
主要结果
一、Sirt6基因敲除导致脂肪肝，伴随着广泛的与脂质相关的基因表达改变以及H3K9和H3K56乙酰化水平的增加
作者首先将Sirt6-LKO小鼠分成几个组，以研究：老年小鼠自发性肝癌的发展，经过DEN处理后的化学诱导肿瘤形成，以及通过与ob/ob突变小鼠杂交引起的肥胖诱导的肿瘤形成（图1A）。同时，为了识别与Sirt6缺失和脂肪肝直接相关的Sirt6下游 mediators，作者对8个月大的Sirt6co/co（Sirt6 Floxed）和Sirt6-LKO小鼠的肝脏进行了RNA测序（RNA-seq）定量转录组分析。在这个年龄，由于Sirt6被靶向破坏，突变小鼠患有脂肪肝（图EV1A）。
RNA-Seq：与对照小鼠 control mice 相比，Sirt6-LKO 小鼠中有227个上调和212个下调的差异表达基因（DEGs）（图1B）。上调的DEGs大多富集在脂质代谢过程（图1C），而下调的DEGs则富集在免疫应答过程（图EV1D）。GSEA分析显示上调差异表达基因与花生四烯酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成过程相关，这表明Sirt6敲除后肝脏的脂质稳态发生了失调。
为了确定Sirt6的直接靶标，作者主要关注了上调的基因，因为已知Sirt6缺失会导致染色质开放，从而增加基因表达。
ChIP-Seq：Sirt6通过作为H3K9ac和H3K56ac的特定去乙酰化酶来抑制转录。为了研究Sirt6依赖的组蛋白去乙酰化作用影响基因表达的基因组区域，作者在Sirt6 Floxed和Sirt6-LKO小鼠中进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析，分别使用针对H3K9ac和H3K56ac的抗体。
根据在10kb范围内进行的metagene分析，H3K9ac和H3K56ac在肝脏中的增强结合峰最常出现在基因体的转录起始位点（TSS）附近。然后以全基因组的方式映射结合位点，发现相比于Sirt6 Floxed肝脏，在Sirt6-LKO肝脏中基因体的2kb区域内转录起始位点（TSS）处有更强的结合模式。在Sirt6-LKO小鼠中，H3K9Ac和H3K56Ac分别显示出2816和6127个增加的结合位点（图1E），表明这些基因主要受到Sirt6依赖的组蛋白标记的影响。
RNA-Seq&ChIP-Seq联合：RNA-seq上调DEGs和转录起始位点（TSS）处H3K9ac或H3K56ac结合增加的基因进行韦恩图分析，分别鉴定出93个和47个基因（图1F），表明这些基因是最有希望的Sirt6依赖的组蛋白去乙酰化靶标基因。
二、Sirt6基因敲除上调了由转录因子CEBPα介导的Serpina12的表达
RT-PCR分析：在Sirt6突变型肝脏组织中，47个基因中有29个基因显著上调（图EV2A）；
基本假设：Sirt6去乙酰化酶的直接下游靶标基因应该在其启动子区域包含H3K9ac和H3K56ac结合位点，并且这些基因在3个月和8个月大的Sirt6突变型肝脏中表达上调。
基于这一标准，作者鉴定出五个基因（图2A、B和EV2B）。其中，Serpina12、Cyp2b10、Gal3st1和Orm3在进一步验证后被发现在肝脏组织中显著上调（图2C）。因此，作者获得了4个符合特定标准的候选基因。
体外实验验证：Serpina12和Cyp2B10在原代肝细胞中的表达显著增加（图2D）。
在这项研究中，作者挑选了变化最显著的基因，Serpina12，作为进一步分析的候选基因。一旦Sirt6缺失，Serpina12在不同年龄的小鼠肝脏组织中无论是在mRNA（图2E）还是在蛋白水平（图2F）上都高度表达，这在Sirt6-LKO小鼠中也有所体现。
HepG2细胞中使用不同的shRNA进行SIRT6急性敲低：SIRT6敲低后，SERPINA12的表达增加（图2G、H）。
总的来说，这些数据表明SIRT6对SERPINA12有负向调控作用，因此SIRT6的缺失导致了SERPINA12的上调。
三、ChIP-seq分析：Serpina12基因组区域的H3K9ac和H3K56ac水平特征
IGV显示在Sirt6缺乏组中，两个区域在转录起始位点（TSS）附近含有更多的结合峰（图3A）。
ChIP-qPCR验证enriched binding peak：与对照组相比，Sirt6-LKO肝脏中H3K9ac和H3K56ac的水平有显著增加（图3B）。
为了确定哪些转录因子可能调控Serpina12的表达，ChIP-seq数据分析发现活性结合区域位于Sirt6缺乏组中Serpina12的转录起始位点（TSS）附近（图3C）。使用在线软件（Genomatix Software Suite）分析这个区域，发现几个可能与其结合的潜在转录因子，包括Cebpα、Pparγ和Srebf1（图3C）。
共转染实验与荧光素酶报告基因检测：验证CEBPα转录因子可以调控 Serpina12基因的表达
1）与对照组相比，CEBPα显著增强了荧光素酶的活性（图3D和EV3A、B） 2）Serpina12基因座的转录起始位点（TSS）附近与CEBPRE的结合位点有~90%的相似性共识序列 3）实验验证Sirt6通过CEBPα调节Serpina12的表达：原代肝细胞中敲除Sirt6，并共转染CEBPα和Serpina12启动子到这些细胞。
四、Serpina12基因功能实验探索
Serpina12在Sirt6缺乏的条件下在肝脏中高度表达，并且其过表达与IRS1磷酸化水平的增加相关联，表明Serpina12可能通过增强IRS1的激活来促进胰岛素信号传导（图4A、B)。
图4A、C：通过感染原代肝细胞以腺病毒-Cre（adeno-Cre virus）敲除Sirt6，同时敲除或敲低Serpina12，并观察到胰岛素信号传导出现下降。这一结果与已有研究相符
图4D：高浓度的葡萄糖无论是在mRNA还是蛋白水平上，能够增强Serpina12在肝脏中的表达
图4E：在高葡萄糖条件下，Sirt6基因敲除（KO）小鼠的肝细胞中脂质生成增加，而敲低Serpina12则能够抵消Sirt6缺失引起的脂肪生成
实验结果表明Serpina12基因的功能为：增强Sirt6缺乏小鼠肝脏中的胰岛素信号传导，并促进了肝脏的脂肪生成。
最终总结图见图4G。
五、Serpina12对Sirt6缺乏引起的脂肪生成和脂肪肝形成的影响
这一段主要是为了理解Serpina12如何影响脂肪生成，做了各种实验，大致思路是这样：
体外实验：高浓度葡萄糖条件下，敲除Sirt6或敲低Serpina12的原代肝细胞：甘油三酯从头合成的关键酶增加，如果敲除Serpina12，则显著降低（Fig. 5A）；
体内实验：通过CRISPR/Cas9 sgSerpina12的流体动力学尾静脉注射方法，在Sirt6基因敲除（LKO）小鼠中建立了Serpina12基因敲除模型（图6B），肝脏切片显示，在Sirt6基因敲除（LKO）且Serpina12敲除的组别中，脂滴明显减少（图5B），这表明Serpina12在体内促进了脂肪生成。
与葡萄糖和脂质代谢相关的转录因子Pparg，在双重基因敲除组中有所下降（图5C）。
此外，葡萄糖代谢的关键酶G6PC和LPK，以及脂肪酸合成的关键酶脂肪酸合成酶（Fasn）和Elovl6，在双重敲除组中与Sirt6 LKO小鼠相比显著降低（图5C）。
GEO数据库（GSE89063）：在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者中，与体外人类肝脏模型（模拟健康肝脏的低葡萄糖和低胰岛素条件）相比（图5D），SERPINA12的表达显著增加。
TCGA数据库：SERPINA12水平、FASN水平和患者生存率之间存在相关性，高SERPINA12表达水平与高FASN表达水平相结合时，总体生存率的预后最差（图5F），相比之下，高FASN表达与低SERPINA12表达的组合预后较好（图5E）。
结论：因此，Sperina12通过影响与葡萄糖和脂质相关的基因表达来促进脂肪生成。
六、Sirt6缺乏导致小鼠中富含脂质的环境加速肝细胞癌（HCC）的形成
对大约两岁的Sirt6基因敲除（LKO）小鼠进行检查，清晰地发现在7只突变小鼠中有6只（86%）自发形成了肝细胞癌（HCC），这一比例是对照组的三倍以上（图6A、B和EV5A），这表明Sirt6在肝癌中扮演着肿瘤抑制因子的角色。
在出生后第14天给Sirt6基因敲除（Floxed和LKO）小鼠注射了二乙基亚硝胺（DEN），这是一种已知的肝脏致癌物，然后在小鼠长到7个月大时检查癌症的形成（图6C、D），Sirt6基因敲除（Floxed）小鼠和Sirt6基因敲除（LKO）小鼠的肿瘤发生率分别达到了91%（11/12）和100%（12/12）（图EV5C）。
由肥胖驱动的肝细胞癌（HCC）小鼠模型显示：在肥胖小鼠中Sirt6基因敲除（LKO）显著加速了HCC的发展（图6E、F）。Serpina12在富含脂质的肿瘤区域表达增强（图6G和EV5J），这表明Sirt6的缺乏通过上调Serpina12表达导致了一个富含脂质的环境，从而加速了肝癌的形成。
小结
总之，这项研究提供了一个潜在的机制：Sirt6的敲除触发了Serpina12的上调，从而诱导出一个“富含脂质”的环境，这有利于肝癌的发展（图7）
实验机制太烧脑了！
