2024年12月16日，厦门大学生命科学学院刘亮教授团队在《Nucleic Acids Research》期刊上在线发表了题为“DNA target binding-induced pre-crRNA processing in type II and V CRISPR-Cas systems”的研究论文，该研究首次揭示了当CRISPR-Cas系统的效应蛋白结合到目标核酸时，能够激活对pre-crRNA（前体crRNA）进行反式切割的能力，并利用这一特性开发了一种新的核酸检测方法。这项研究特别重要的一点是，它首次证明了CRISPR-Cas12a系统在与体内目标DNA结合后可以对pre-crRNA的间隔区进行反式切割。这个发现对于基于Cas12a的基因编辑工具的发展有着深远的影响。
CRISPR-Cas是一种源自细菌和古细菌的适应性免疫机制，用来对抗病毒和其他外源遗传物质。CRISPR-Cas的工作过程分为三个阶段：获取新的间隔序列、加工成熟CRISPR RNA (crRNA)，以及干扰外来核酸。crRNA的成熟是CRISPR效应复合物发挥功能的关键步骤，这涉及pre-crRNA中重复序列和间隔序列的处理。之前的研究显示，在II型CRISPR-Cas系统中，crRNA的重复序列与tracrRNA配对后由RNase III酶切割；而在V型系统中，CRISPR-Cas效应蛋白直接负责pre-crRNA重复序列的加工。然而，关于间隔序列是如何被加工的，尚不清楚。
在这项新研究中，研究人员首先观察到未成熟的间隔序列显著降低了V型CRISPR-Cas12a系统的顺式和反式切割活性，表明间隔序列的成熟对Cas12a的活性至关重要。他们进一步发现，靶标DNA可以在体外激活Cas12a的RuvC结构域来加工pre-crRNA的间隔区域。此外，他们在其他V型CRISPR-Cas成员如Cas12b、Cas12i和Cas12j，以及II型CRISPR-Cas9中也观察到了类似现象。为了验证这种加工是否也在体内发生，研究人员使用大肠杆菌异源表达系统模拟体内条件，证实了CRISPR-Cas12a在体内结合target DNA后确实会对pre-crRNA进行进一步加工。通过解析一系列Cas12a和Cas9与target DNA及crRNA形成的复合物晶体结构，研究人员提出了基于crRNA种子序列的初始靶标识别机制和构象变化依赖的RuvC核酸酶结构域激活机制。
基于上述研究成果，研究团队开发了一个名为PDCD（Pre-crRNA-dependent Cleavage Detection）的新平台，用于核酸检测。PDCD方法利用荧光基团和淬灭基团连接在pre-crRNA间隔区切割位点两侧的技术，当Cas12a结合目标核酸并激活pre-crRNA反式切割时，荧光信号被释放出来，从而实现对DNA的检测。研究团队用此平台成功地实现了对猴痘病毒和SARS-CoV-2病毒的高特异性、高灵敏度的快速检测，显示出该技术在分子诊断领域的应用潜力。
厦门大学生命科学学院刘亮教授和陈霁云助理教授为该论文的共同通讯作者，助理教授陈霁云、2022级博士研究生林晓峰为该论文的共同第一作者，博士研究生相文文、陈莹、黄玲珑以及硕士研究生赵越明参与了该论文的研究。该研究得到了国家自然科学基金、厦门市自然科学基金和福建省自然科学基金的支持。
