【万能代码分享】一键搞定Limma包配对/非配对差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析！

我们下载好series_matrix探针矩阵文件之后，将开头和最后一行！的行删掉，并修改文件名为input【1_input.txt】（对于任何的探针矩阵，你都可以处理成这样行名是探针名，列名是GSM样本名，我们这里是18比18，共36个样本，我会教大家非配对差异分析+配对差异分析），作为我们此次分析的输入文件，并和GPL文件【1_PlatformMap.txt】和代码文件【0_GEO_limma（配对+非配对）.R】放在一个文件夹下：

万能代码运行之后，你会得到所有的结果：

差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析，万能代码一键搞定。

“Limma包配对/非配对差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析全套万能代码（附代码交流群）”

如下免费下载：

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②对话框输入关键词：配对非配对代码

这个代码，一共需要你修改18个地方，零基础，教会你理论+实操。下面看我来演示：

探针矩阵【1_input.txt】，GPL平台文件【1_PlatformMap.txt】和代码文件【0_GEO_limma（配对+非配对）.R】放在一个文件夹下，input矩阵是行名是探针名，列名是GSM样本名，我们这里是18比18，共36个样本，打开如下，：

平台文件是我们自己整理的，网上也有很多可以下载，大家也可以自行下载，里面是平台GPL和需要的ID转换R包一一对应，告诉我们哪个GPL平台用哪个R包去进行ID转换：

打开代码：

代码一共分为10个步骤：

### 1.读入探针矩阵数据--公众号：科研部### 2.数据预处理：NA去除+log2转换+样本芯片矫正### 3.探针ID和基因名symbol转换### 4.基因Symbol表达矩阵获取：探针矩阵转换为基因Symbol矩阵+同名symbol保留表达量的最大值。### 5.使用limma包来做芯片的差异分析(非配对)------选一个就行### 5.使用limma包来做芯片的差异分析(配对)------选一个就行### 6.输出差异基因### 7. 作图，差异表达图、热图、火山图### 8. 差异基因集的GO分析### 9. 差异基因集的KEGG分析### 10. 差异基因集的GSEA富集分析

第零步，添加镜像，免得后面安装R包报错：

第一步，读入探针矩阵：

读入：

点击看一下矩阵：

恩，OK，这个时候我们注意，行名是探针的ID，后面我们要进行ID转换，将探针的ID转换成基因的Symbol。那这里进行下一步。

第二步，表达矩阵预处理：

首先是将探针矩阵赋值给ex矩阵，随后NA去除+log2转换后，看看样本间芯片怎么样（样本间差异需要去除）：

不平，我们需要矫正（不管前面平不平，都可以进行矫正处理），矫正之后平了：

第三步，探针ID和基因名Symbol转换：

输入GPL6102探针平台（每一个测序GSE都有对应的GPL平台，不知道的去看我推文开头说到的两篇推文，都有说），看看该探针ID是用什么R包将探针ID转换成基因symbol的，这里是illuminaHumanv2.db（万能代码第1处需要你改的地方，就是输入平台号）。

那么，我们就需要下载该包、加载该illuminaHumanv2.db包（万能代码第2、3处需要你改的地方，就是安装加载该包）：

那加载之后，不知道用这个包里面的什么函数将探针ID转换成，就在右下角搜索：

这里可以看到是illuminaHumanv2SYMBOL函数会变成Symbol（万能代码第4处需要你改的地方，就是输入对应的函数）：

运行代码：

发现我们的制作probe2symbol转换文件建立成功，打开看看（建立成功之后，我们就要进行真正的转换了）：

第四步、基因Symbol表达矩阵获取：

一个基因会对应对个探针，有些基因名称会是重复的，这些都需要处理。对于多个探针，我们选取在样本中平均表达量最高的探针作为对应基因的表达量。一下代码完成所有事情，而且可以复用。

转换成功，打开看看，此时行名已经是基因symbol了，我们可以继续差异分析了：

我们可以看到探针矩阵ex里面有48701行，而转换后的exprset基因symbol矩阵有18944行，减少了很多没用的探针，或者由于一个探针注释到同一个基因名的原因。

第五步、使用limma包来做芯片的差异分析---非配对差异分析：

首先就是分组，分组之后用PCA从转录组水平的维度来分析，看看分组怎么样，是否两组分的很开，能否进行后续的差异分析（万能代码第5处需要你改的地方，就是输入对应的样本数）：

我们可以看到其实，有个别样本分的不好（807370不好感觉），应该要在input文件里面将这个样本删除才行的，这里我们不删除，继续给大家演示，那大家自己做分析的时候，看到分组不好，就要回到第一步，将input里面的807370这一列删除后再继续读入。

非配对limma差异分析，我们可以看到差异分析之后，adj.P小于0.05的有6793个（allDiff=topTable(fit2,adjust='fdr',coef=2,number=Inf, p.value=0.05)#把，此处的P是adj.P，p.value=0.05删掉就是所有的分析结果）：

第五步、使用limma包来做芯片的差异分析---配对差异分析：

那如果你的数据是配对的，你就运行这个第五步，不要运行前面的哪个第五步了，如下：

一样的，还是先分组：

随后limma配对差异分析，并保存结果：

一共是7633个，用我们之前的Limma包非配对的差异分析代码，结果就是有allDiff得到6799行。所以，不配对和配对还是有差异的。

那我这里就用配对的继续演示吧（反正你们自己选一个第5步就好）：

第六步、筛选差异基因：

我这里是adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >0.5为阈值，要记住这个基因集，我们后面就用来做GO\KEGG分析了。（自己需要修改的6、7处代码）

结果文件里面有P、logFC、还有具体的表达矩阵，方便我们做实验的时候挑选合适的分子，P小的，logFC变化大的，矩阵对照组很低，实验组很高的，这样子去挑选：

第七步，作图。

做某一个基因的图（第8处改，自己想看哪个基因就改成哪个基因的名字）：

9、10改也是一样，想看谁改成谁：

接着画一些基因的热图（选取一群adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >1的差异基因做热图，如果你的基因很多，你就缩小一下这个阈值，如果你的基因很少，你就放大一下这个阈值，第11、12、13处就是这样改），：

记得把图片保存为eps格式（后期用AI组图）：

接着我们画火山图（分别是logFCfilter = 0.5### 筛选标准和logFCcolor = 1### 筛选标准对应的两种阈值，你自己想怎么画就改成什么阈值就行）：

第八步，差异基因集的GO富集分析：

这里，我们导入我们之前保存的adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >0.5为阈值的差异基因，做GO分析：

结果，这里是给你自动保存了P小于0.05的富集结果，而不是adj.P：

第九步，KEGG分析：

结果如下：

第十步、GSEA富集分析：

GSEA富集分析跟GO、KEGG分析不一样，GO、KEGG是做的差异基因，GSEA做的是所有基因，意义不一样。

运行之后打开结果看看（P小于0.05的结果）：

然后，自己将自己感兴趣的结果可视化出来：

这样，我们全套就搞定了，基本上，代码都是万能的了，要改的参数非常少，就算有，里面也写的非常清楚，0基础就能看懂。16、17、18需要改的地方如下：

代码和演示数据我都上传了：

如下免费获取：

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