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【万能代码分享】一键搞定Limma包配对差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析！

文摘 2024-11-14 21:52 美国

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一键搞定GEO芯片测序

之前我们已经给大家分享了GEO芯片测序limma差异分析非配对的万能代码（点击查看下载）

我们从GEO下载芯片测序（Array）数据之后，一般都是用limma包进行差异分析。那，今天我们给大家分享的是：

“Limma包配对差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析全套万能代码（附代码交流群）”

如下免费下载：

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②对话框输入关键词：220708配对

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是全套的万能代码，自动判断是否需要log2转换，自动ID转换，自动同基因名处理，你只要知道下载的数据有几个样本就行。大家可以进群，群内不答疑，可代码共享。下面开始操作：

从生物医学之家进入GEO数据库，检索自己想要的测序数据（GSE是测序的代号）：

我这里以GSE32575为例，检索之后进入该测序的主页：

我们可以看到，是array芯片测序数据（要注意与sequence区分），有18个配对的样本（药物处理前后测序的数据）。

那我们用R语言跑代码来做（这一套代码是万能代码，全套代码你只需要修改两个参数，其他什么都不用管，比如是否需要log，同基因名怎么办等等，这些你都不需要考虑）。

我们点击下载基因表达矩阵(同时记住测序公司的平台是GPL6102，同时要记住每一个GSM样本是什么，是药物处理前还是后，这样我们后面才好分组，跑代码的时候要用)：

下载如下，是txt格式文件，下载后命名为【1_GSE32575_series_matrix(配对).txt】，随后我们还要准备代码文件【0_GEO_limma（配对）.R】和平台文件【1_PlatformMap.txt】，我们把这三个文件放在一个文件夹下：

分别打开看看R代码：

再看看矩阵格式，可以看到下面就是我们要的矩阵（行名是探针名，列名是样本名，但是我们分析样本名称之后，前面的12列样本不是我们要的，我们要的是后面18+18列配对的样本，后续进行差异分析）

平台文件是我们自己整理的，网上也有很多可以下载，大家也可以自行下载，里面是平台GPL和需要的ID转换R包一一对应，告诉我们哪个GPL平台用哪个R包去进行ID转换：

随后，我们就可以打开代码。具体如下（万能代码）：

第零步，添加镜像，免得后面安装R包报错：

第一步，读入探针矩阵文件，提取探针表达矩阵：

读入之后，删除带！的行，也删除1-12不要的样本列，得到真正的18-18，共36个样本的探针矩阵：

点击看一下矩阵：

恩，OK，这个时候我们注意，行名是探针的ID，后面我们要进行ID转换，将探针的ID转换成基因的Symbol。那这里进行下一步。

第二步，表达矩阵预处理：

首先是NA去除+log2转换后，看看样本间芯片怎么样（样本间差异需要去除）：

矫正之后变平了（不管前面平不平，都可以进行矫正处理）：

第三步，探针ID和基因名Symbol转换：

先看看GPL6102探针平台，探针ID是用什么R包将探针ID转换成基因symbol的，这里是illuminaHumanv2.db。

那么，我们就需要下载该包加载该illuminaHumanv2.db包：

那加载之后，不知道用这个包里面的什么函数将探针ID转换成，就在右下角搜索：

这里可以看到是illuminaHumanv2SYMBOL函数会变成Symbol：

运行代码：

发现我们的制作probe2symbol转换文件建立成功，打开看看（建立成功之后，我们就要进行真正的转换了）：

第四步、基因Symbol表达矩阵获取：

一个基因会对应对个探针，有些基因名称会是重复的，这些都需要处理。对于多个探针，我们选取在样本中平均表达量最高的探针作为对应基因的表达量。一下代码完成所有事情，而且可以复用。

转换成功，打开看看，此时行名已经是基因symbol了，我们可以继续差异分析了：

第五步、使用limma包来做芯片的差异分析---配对差异分析：

首先就是分组，分组之后用PCA看看分组怎么样，能否进行后续的差异分析：

我们可以看到其实，有个别样本分的不好（807370不好感觉），应该要删除才行的，这里我们不删除，看看结果怎么样先。

配对差异分析：

总的分析结果如下：

我们打开看看：

一共是7633个，用我们之前的Limma包非配对的差异分析代码（点击下载该代码），结果就是有allDiff得到6799行。所以，不配对和配对还是有差异的。

接着，我们选用adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >0.5为阈值，筛选差异基因，将差异结果保存下来：

结果如下（注意：后期我们做GO和KEGG功能富集分析的时候又要重新导入这个差异基因表格做分析）：

记住CHD9这个基因，logFC为0.916328829830393；R3HCC1为-0.513266822373539。我们接着用GEO在线差异分析工具GEO2R进行差异分析一下（注意，GEO2R是不区分配对不配对的），如下：

恩，结果发现CHD9和R3HCC1和我们的分析结果还是有区别。所以，该配对的时候还是配对，这样比较好。继续分析。

第七步，作图。

做某一个基因的图：

接着画一些基因的热图（选取一群adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >1的差异基因做热图），：

记得把图片保存为eps格式（后期用AI组图）：

接着我们画火山图（分别是logFCfilter = 0.5### 筛选标准和logFCcolor = 1### 筛选标准对应的两种阈值）：

第八步，差异基因集的GO富集分析：

这里，我们导入我们之前保存的adj.P.Val < 0.05和abs(logFC) >0.5为阈值的差异基因，做GO分析：

结果，这里是给你自动保存了P小于0.05的富集结果，而不是adj.P：

第九步，KEGG分析：

结果如下：

第十步、GSEA富集分析：

运行之后打开结果看看（P小于0.05的结果）：

然后，自己将自己感兴趣的结果可视化出来：

这样，我们全套就搞定了，基本上，代码都是万能的了，要改的参数非常少，就算有，里面也写的非常清楚，0基础就能看懂。

代码和演示数据我都上传了：

如下免费获取：

“Limma包配对差异分析+热图+火山图+GO分析+KEGG分析+GSEA分析全套万能代码（附代码交流群）”

如下免费下载：

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