生信分析是指利用生物信息学工具、方法和技术对生命科学数据进行分析和研究的一个领域。主要包括两大类：一类是对DNA、RNA、蛋白质和代谢物进行定量和定性分析；另一类是对复杂的生物信息数据进行图形化展示、可视化分析以及机器学习方面的应用。目前对大量生命科学数据的有效处理、分析以及可视化呈现这一手段也得到了越来越广泛的应用，也是如此，“生信分析+热门疾病”申请国基金仍是不错的一个策略。
今天分享一篇生信分析：hub基因相关的研究思路，准确说是生信分析研究食管癌相关的研究：“Exploring the hub genes and mechanisms of Daphne altaica treating esophageal squamous cell carcinoma based on network pharmacology and bioinformatics analysis”，这篇论文于2023年4月23日发表在Journal of Cancer Research and Clinical Oncology（IF：4.32）。
原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s00432-023-04797-w
背景介绍
食管癌（EC）是一种常见的消化道恶性癌，病死率高，也是第七大侵袭性恶性肿瘤，由于早期检测的生物标志物缺乏，其治疗仍然是一个挑战。阿尔泰瑞香（Daphne altaica）是一种分布在阿尔泰山脉的稀有药用植物，在哈萨克传统医学中经常使用，它的药用部位是茎皮，用于治疗癌症和呼吸系统疾病。尽管具体的作用机制尚不清楚，但初步研究表明阿尔泰瑞香可能通过上调细胞内PPARγ基因表达诱导细胞凋亡，导致细胞周期停滞。因此作者使用网络药理学结合生物信息学分析和分子对接，探讨哈萨克族传统药物阿尔泰瑞香治疗ESCC的hub基因和机制，并期望将为ESCC的治疗做出贡献。
研究思路总结
作者通过TCMSP、BATMAN–TCM等数据库筛选得到阿尔泰瑞香的活性化合物和靶点，ESCC靶标则是通过GeneCards数据库，进而构建复合靶标网络和PPI网络。同时，分析GEO数据库（GSE100942，GPL570）中组织和邻近非癌组织之间的数据集，分析获得127个DEGs（上调82个，下调45个）。作者筛选了TOP2A、NUF2、CDKN2A、BCHE和NEK2等hub基因，并使用Kaplan-Meier绘图仪数据库、TIMER2.0和GEPIA2数据库对hub基因进行验证。最后，利用AutoDock软件通过分子对接来预测结合位点，分子对接结果显示5个hub基因和活性化合物的连接更稳定。
图1.研究思路图
研究步骤
Step1：构建化合物靶标网络和PPI网络
作者通过TCMSP、BATMAN–TCM等数据库筛选得到阿尔泰瑞香的活性化合物靶点，基于13种活性药物化合物和830个靶标，作者使用Cytoscape 3.9.1构建了化合物靶标网络（图2a）。该网络由一种药物、13种化合物和830个化合物靶标组成，化合物按度值排序。程度值越高，它所涉及的生物功能就越多，其生物重要性就越强。同时，作者通过Venn图得到了409个药物疾病的重叠基因（图2b）。然后，使用STRING数据库来获取PPI信息。之后，作者将其放入Cytoscape 3.9.1中，以获得PPI网络图（图2c），并根据Degree值设置蛋白质大小。
图2.化合物靶标网络与PPI网络图
Step2：差异表达基因的获取
作者通过GEO数据库获得了ESCC患者癌症和癌旁组织的RNA提取和杂交数据，并使用R Studio获得了微RNA数据的DEGs，一共获得127个DEG，包括82个上升和45个下降（补充表1）。生成火山图（图3a）、热图（图3b）和主成分分析图（图3c，d），以显示DEG的分布。GSEA图（图3e，f）显示，DEG与真核生物中的DNA复制、Fanconi贫血途径、糖氨基聚糖生物合成-硫酸keratan、同源重组、错配修复、细胞周期、核质运输、蛋白酶体和核糖体生物发生密切相关。
图3.差异表达基因相关图
Step3：获得hub基因
作者筛选了用于阿尔泰瑞香治疗ESCC的基因，并获得了12个重叠基因作为治疗的hub基因，包括BCHE、CDC20、CDKN2A、CXCR2、IL6、MMP1、MMP3、MMP12、NEK2、NUF2、PTGS2和TOP2A。
图4. 阿尔泰瑞香治疗ESCC的基因筛选
Step4：预后分析筛选hub基因
作者通过Kaplan–Meier绘图仪数据库对12个重叠基因（BCHE、CDC20、CDKN2A、CXCR2、IL6、MMP1、MMP3、MMP12、NEK2、NUF2、PTGS2和TOP2A）进行了生存分析，获得了5个显著基因（p < 0.05），并将其用作hub基因，包括TOP2A、NUF2、CDKN2A、BCHE和NEK2（图第5a）。
图5.预后分析筛选hub基因
Step5. 分子对接验证
作者使用五个枢纽基因NEK2（PDB:6SGH）、CDKN2A（PDB:1DC2）、BCHE（PDB:4AQD）、TOP2A（PDB:4R1F）和NUF2（PDB:2VE7）与阿尔泰瑞香的两种最具活性的化合物进行分子对接，使用AutoDock 4.2.6。发现NEK2-Apigenin (PubChem CID: 5280443)，CDKN2A-Apigenin，BCHE-Apigenin, TOP2A-Apigenin， NUF2-Apigenin,，NEK2-Luteolin (PubChem CID: 5280445), CDKN2A-Luteolin, BCHE-Luteolin, TOP2A-Luteolin和NUF2-Luteolin 都具有良好的结合亲和力。最后，使用PyMOL2.5软件对分子对接图进行可视化，可视化结果如图6所示。
图6. hub基因与活性化合物的分子对接可视化结果
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