胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其中恶性程度最高的是胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM），治疗手段和效果非常有限。胶质母细胞瘤干细胞（Glioblastoma stem cell，GSC）的存在是导致疗效不佳的重要原因之一，认识和靶向GSC具有重要的意义。
2024年3月22日，中山大学张弩及匹兹堡大学Jeremy N. Rich共同通讯在Nature Cancer（IF：22.7）杂志上发表题目为“Threonine fuels glioblastoma through YRDC-mediated codon-biased translational reprogramming”的文章。通过CRISPR等技术发现GSC同时上调YRDC表达和下调苏氨酸分解代谢，促进tRNA第37位腺苷发生t6A修饰，导致整体翻译加速，同时以ANN密码子偏好性的方式促进增殖相关转录本翻译。肿瘤t6A水平受到微环境中苏氨酸浓度的动态调控，苏氨酸限制饮食有效降低血清苏氨酸浓度，抑制肿瘤t6A和异常蛋白翻译，延缓肿瘤进程。
1. GSCs具有高翻译率
GSCs是一种干细胞样群体，对放疗和化疗有着很强的抵抗力，且会在肿瘤内产生细胞类型的分级。不仅如此，研究者还通过小鼠以及体外实验证实，GSCs具有较高的翻译率，这意味着GSCs的蛋白质合成率相对较高，而这种高翻译特征更是增加了GBM的侵袭性。
图1 GSCs表现出高翻译速率。a. 不同细胞群体体内蛋白质翻译测量的图示，使用人（h）CD147标记患者来源的肿瘤细胞；使用CD133和SOX2区分GSCs。b–i. GSC23衍生的颅内肿瘤中指示细胞群体的OPP流式细胞术分析的分选策略（b，g），代表性直方图（c，e，h）和统计量化（d，f，i）。用来定义高（OPPhi）和低（OPPlo）OPP信号的临界值在对数刻度上是103。j–l. 28种早期传代GSC培养物和来自24位患者的14,207个GBM患者恶性细胞的scRNA-seq数据中翻译活动的量化。m. 在匹配的GSCs和DGCs（GSE54791）的RNA-seq数据中进行GOBP：翻译正向调控的GSEA分析。n-o. 指示细胞中的嘌呤霉素结合的免疫印迹。p. 指示细胞体外OPP结合的代表性图像。
2. GSCs中tRNA修饰剂的CRISPR筛选
研究者进一步采用CRISPR基因敲除筛选，探讨了影响GSC生长和翻译的潜在tRNA修饰因子。靶向111个基因进行筛选之后，最终找到了——YRDC。
具体来说，研究者在GSC456细胞筛选中，发现了9种重要的命中（hits）基因；而GSC23细胞筛选中则发现了12种。其中，仅有YRDC和RPUSD2两个基因发生了重叠。基于此，研究者总结道，YRDC是GSCs中最重要的tRNA修饰剂。更准确地说，在大多数癌细胞系中，YRDC都是必不可少的。
图2 GSCs中tRNA修饰因子的CRISPR筛选。a. 针对tRNA修饰基因的CRISPR敲除筛选的图示。b-c. GSC456（b）和GSC23（c）细胞在CRISPR筛选中的负选择结果基因排名。y轴上的值越低表示基因的必要性越高。d. 从b-c得到的负选择结果中的显著命中基因，红色标注的是参与t6A生物合成的酶，韦恩图显示了两个筛选中重叠的命中基因。e–i. 五种GSCs的全基因组CRISPR敲除筛选中tRNA修饰基因的基因排名，突出的命中基因和YRDC被标记出来。j. 基因排名图显示GSCs和NSCs中每个tRNA修饰酶的平均四分位数归一化BF（qBF）分数的差异，数据来自24种GSCs和四种NSCs的全基因组CRISPR敲除筛选，突出的命中基因和YRDC被标记出来。k. DepMap CRISPR敲除筛选中不同细胞系中YRDC依赖性的Chronos分析。l. 热图显示五种癌症细胞系和一种未转化上皮细胞系中YRDC的z转换BF分数。
3. YRDC对GSC的维护和翻译至关重要
经过一系列分析，研究者发现，靶向YRDC能够降低GSCs的存活率，消耗YRDC会降低GSC的自我更新能力，同时，缺乏YRDC的GSCs也会表现出较慢的翻译速率。可见，YRDC在GSC维持过程中发挥着重要作用。
图3 YRDC对GSC的维持和翻译至关重要。a. 火山图显示GSCs与DGCs的RNA-seq数据中tRNA修饰酶的差异表达，红点表示在GSCs中上调，蓝点表示下调。b. 热图显示TCGA_GBM和基因型-组织表达（GTEx）脑皮质RNA-seq数据中编码tRNA修饰酶的基因表达，及在GBM中上调的编码酶的基因被标记，也被称为QNG1。c. 韦恩图显示在GBM和GSCs中都上调的编码tRNA修饰酶的基因。d-e. 免疫印迹显示在指示细胞中的YRDC、GFAP和OLIG2表达。GFAP是分化标志物，OLIG2是干细胞标志物。f-i. 敲低YRDC后GSCs的细胞活力和EdU结合的量化。j–m. 在敲低或未敲低YRDC的GSCs中的极限稀释测定（j–l）和球形成量化（m）。n-o. 在转染了指示shRNA的GSC456细胞中，t6A水平的MS分析和YRDC表达的qPCR分析。p. 免疫印迹显示在转染了指示小干扰RNA（siRNA）的GSCs中嘌呤霉素结合和YRDC表达。
4. 苏氨酸动态调节t6A和翻译
事实上，YRDC发挥作用的根源在于：催化tRNA上N6-苏氨酰氨甲酰腺苷（t6A）的生物合成，从而发挥调节GSCs中蛋白质翻译的功能。质谱分析（MS）显示，当靶向YRDC时，则可以减少t6A，阻碍蛋白质翻译，在体内和体外均能抑制肿瘤生长。
图4 苏氨酸动态调控t6A和翻译。a. t6A生物合成的图示。红色表示本研究的重点。b. 在[13C4,15N]L-苏氨酸追踪实验中6 小时标记t6A的MS分析。c. 从在指示培养基中培养72 小时的GSC456细胞中提取的tRNA的t6A（左）和总腺苷（右）的MS分析。d-e. 在指示培养基中培养72 小时的GSCs中嘌呤霉素结合的免疫印迹。f. 在指示培养基中培养72 小时的三种GSC样本中磷酸化（p）-mTORS2448、mTOR、p-eIF2αS51和eIF2α表达的免疫印迹。g-h. 在指示培养基中培养72 小时的GSC456和GSC23细胞中嘌呤霉素结合和YRDC表达的代表性免疫印迹（g）和量化（h-n）。i. 在指示培养基中培养72 小时的两种GSC样本中p-mTORS2448、mTOR、p-eIF2αS51和eIF2α表达的免疫印迹。j. 在指示培养基中培养72 小时的两种GSC中tRNAThr负载水平的Northern印迹。去酰基tRNA比氨基酰-tRNA（aa-tRNA）跑得更快。k. 检测指示细胞中胞内苏氨酸水平的苏氨酸测定。l–n. 在GSC456细胞中Flag和SDS表达（l）、相对胞内苏氨酸水平（m）和t6A水平的MS分析（n）的免疫印迹。
5. 苏氨酸主要通过YRDC在GSC中起作用
一系列的体外实验显示，苏氨酸能够动态调节t6A水平。具体来说，当提高培养基中苏氨酸的浓度时，即补充苏氨酸72小时后，t6A的浓度得到了提升，但不影响总腺苷水平。
不仅如此，增加苏氨酸水平还能加速翻译。与同样是必需氨基酸的精氨酸相比，补充苏氨酸能够加速翻译，同时不影响mTOR磷酸化水平。事实上，苏氨酸能通过YRDC和t6A的生物合成来促进翻译，从而加速肿瘤的生长。
图5 苏氨酸主要通过YRDC在GSCs中发挥作用。a-b. 在对照或苏氨酸限制（TR，4 μM，72 小时）培养基中培养的GSC456细胞中，敲低或未敲低YRDC的转录组（a）和蛋白质组（b）数据的PCA分析。c–f. 在对照和苏氨酸限制培养基（4 μM，72 小时）中培养的GSC456细胞的转录组数据（c）和蛋白质组数据（e）中，YRDC表达完整的细胞的DEGs和差异表达蛋白的火山图。所有基因都投射到转录组数据（d）和蛋白质组数据（f）中YRDC敲低的GSC456细胞的相同比较，颜色表示这些基因在c，e中的状态。g–j. 在转录组数据（g-h）和蛋白质组数据（i-j）中，苏氨酸限制（4 μM，72 小时）后YRDC依赖的下调和上调基因的生物过程（GOBP）的GO富集分析。
6. 膳食TR抑制肿瘤生长，并且强化了标准疗法
为了更好地模拟苏氨酸饮食限制的临床应用，研究者在植入GSCs的7天后，展开了饮食干预和药物治疗。
结果显示，限制膳食中苏氨酸后，小鼠体内的肿瘤体积明显减少，同时存活率也得到了延长。更具体地说，苏氨酸饮食限制减少了t6A的生物合成，从而抑制肿瘤蛋白合成和肿瘤细胞周期进展；类似的情况也出现在异种移植实验中，膳食限制苏氨酸同样能有效限制体内GSC的蛋白质翻译和增殖。放眼临床，如果能将一线化疗药物替莫唑胺，联合饮食中苏氨酸的限制，则有很大的希望能增强化疗和抗有丝分裂的抗肿瘤疗效，为膳食干预癌症治疗提供了分子基础。
图6 饮食性TR 抑制肿瘤生长。a. 承载指示异种移植物的小鼠的代表性体内生物发光成像（左）和定量（右）。b. 承载指示异种移植物的小鼠的体内生物发光分析的肿瘤生长曲线。c. 承载指示异种移植物的小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。d. 在对照或TR培养基中培养的指示细胞的细胞活力72小时。数据来自四个独立实验。e–h. 携带指示肿瘤的小鼠的体内生物发光成像和定量（e-f）和用指示饮食喂养的小鼠的血液痹和H&E染色的大脑切片的代表图像。i. 用指示饮食喂养的肿瘤携带小鼠的Kaplan–Meier生存曲线。J. 具有指示膳食处理的异种移植物的组织t6A水平的MS分析。k–m. 携带指示肿瘤的小鼠的肿瘤细胞的体内OPP流式细胞术分析的门控策略（k）、代表性直方图图谱（l）和统计量化（m）。
图7 饮食干预增强标准治疗的潜力。a–c. 图形说明（a），对承载GSC468的小鼠进行体内生物发光分析得到的肿瘤生长曲线（b）和Kaplan–Meier生存曲线（c）的指示治疗。d. 用于YRDC的药物治疗效果预测（方法）。蓝点表示顶级抵抗药物，红点表示高YRDC表达的顶级敏感药物。e. 承载GSC468的小鼠进行指示治疗的Kaplan–Meier生存曲线。f-g. 免疫印迹显示GBM（T），配对外周组织（P），非肿瘤性癫痫组织（N），良性脑膜瘤（BM）和不同级别的胶质瘤中YRDC的表达。h. 代表性免疫组化染色显示LGG和GBM中的YRDC表达。i-j. 展示TCGA_GBM和GTEx大脑皮层RNA-seq数据中转译调节途径活性的热图。k-l. TCGA_LGG、GBM（k）和CGGA（l）RNA-seq数据中转译活性的小提琴图。m. 基于YRDC mRNA表达的CGGA_GBM（IDH野生型）的Kaplan–Meier生存曲线。n. CGGA_GBM（IDH 野生型）RNA-seq数据中YRDC表达和转译活性的皮尔逊相关性（n = 183）。
发现GSCs在蛋白合成方面表现出选择性依赖于YRDC的优先调控，YRDC是t6A代中的一种限速酶。与t6A锁定tRNA三级结构的作用一致，GSCs在翻译中表现出依赖于YRDC的密码子偏倚，以维持有丝分裂。利用苏氨酸作为YRDC生成t6A的酶底物的作用，该研究开发了一种策略，通过限制饮食中的苏氨酸，从而抑制肿瘤增殖和体内生长。这些发现共同促进了肿瘤发生过程中代谢调节的额外层面，为改善GBM患者的临床护理提供了治疗范例。
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