分子动力学模拟探索 CYP3A4 配体结合位点

今天给大家介绍一篇 2024 年发表在 Journal of Chemical Information and Modeling 上的文章, 标题为:《Unraveling the Ligand-Binding Sites of CYP3A4 by Molecular Dynamics Simulations with Solvent Probes》。

导读

该研究使用混合溶剂分子动力学模拟，成功识别 CYP3A4 中的多个配体结合位点。

细胞色素 P450 3A4（CYP3A4）是人体中最重要的药物代谢酶之一，它有着复杂的非典型动力学特性。CYP3A4 含有多个配体结合位点，这些位点能够通过变构效应干扰活性口袋。除了血红素上方的规范活性位点之外，识别其他配体结合位点对于理解 CYP3A4 的非典型动力学特性以及配体与受体之间的关联也尤为重要。

在本研究中，研究者首先采用混合溶剂分子动力学（MixMD）模拟，结合在线计算预测工具探索 CYP3A4 中的潜在配体结合位点。MixMD 方法在处理受体灵活性方面优于其他计算工具。从 MixMD 识别的位点中，挑选了多个位点进行诱导契合对接和常规分子动力学（cMD）模拟的深入探索。

研究结果表明，CYP3A4 中存在三个额外的适合配体结合的位点，其中包括一个经实验验证的位点和两个新发现的位点。

材料与方法

蛋白模型的准备

作者选取了三个 CYP3A4 的晶体结构作为 MixMD 模拟的初始模型：无配体形式（PDB: 1TQN）、含配体形式一（PDB: 2V0M）和含配体形式二（PDB: 5A1R）。使用 Schrödinger 的蛋白质准备模块移除了所有原生共晶配体和晶体水分子，并补全了缺失的残基。

溶剂探针的设置与模拟

模拟过程中使用了四种具有不同官能团的溶剂探针：异丙醇（IPA）、N-甲基乙酰胺（NMA）、苯酚（IPH）和吡啶（PYR）。这些溶剂与 TIP3P 水的体积比为 5:95，旨在探测特定的相互作用类型偏好。

混合溶剂模拟系统的构建

使用 AmberTools 的 tleap 模块和 ff14SB 力场以及 Shahrokh 等人开发的血红素参数对蛋白质进行准备。通过 solvateOct 命令，将蛋白质包裹在截断的八面体周期性混合溶剂盒中，并使用氯化物中和系统。

模拟执行与结果评估

模拟的执行

模拟使用 Amber 的 pmemd.cuda 模块在 GPU 上执行，包括能量最小化、系统加热和平衡。最终在 NPT 系综下进行了 500 纳秒的生产模拟。

结果的初步评估

通过 Cpptraj 和自制脚本验证了包含溶剂探针的系统中蛋白的均方根波动（RMSF）和溶剂的运动轨迹。尽管系统中含有大量溶剂，但研究者仅对那些穿过蛋白质并进入活性位点的特定溶剂进行深入研究。

结合位点的识别与验证

使用 MixMD 和网络服务器识别结合位点

通过对不同系统的轨迹重定向和对齐，使用格点命令分析了溶剂探针的分布和密度。溶剂密度图类似于电子密度图，使用 PyMOL 的 isomesh 模块进行可视化。

潜在结合位点的验证

收集了特定的 CYP3A4 配体（效应剂），并通过 Glide v9.1 进行分子对接，进一步验证了通过 MixMD 识别的结合位点。此外，还计算了效应剂与结合位点的相互作用的均方根偏差（RMSD）和结合亲和力。

结果

结论：虽然引入溶剂对 CYP3A4 的动态特性有一定影响，但这些影响较为有限，不会引起蛋白质显著的构象变化。

研究计算了蛋白质主链在溶剂和水环境中的均方根波动（RMSF）值，用以评估溶剂引入的干扰。结果显示，虽然引入多种溶剂对蛋白动态有所影响，例如在 PYR 环境下残基 235 附近的 RMSF 波动以及峰值的改变，但这些变化并不显著，不足以引起蛋白质显著的构象变化。

此外，通过溶剂轨迹的叠加分析，作者发现了五个普遍存在的配体通道，这些通道在不同的设置下均能被观察到，展示了溶剂如何接近血红素上方的活性位点。研究还利用 MixMD Probeview 等工具对溶剂分布进行了归一化处理，并识别并排列了潜在的结合位点。

针对结合位点的进一步评估，作者利用 SiteMap、Cavity Plus 等其他软件工具进行了预测，结果表明这些工具对于已知位点（如 A 位点和 1 位点）的检测较为容易，但对其他位点的预测存在显著差异。此外，通过分子对接技术对几个位点进行了效应因子结合模式的评估，结果显示这些位点能够适应不同结构的效应因子，尽管有的位点（如 2 位点）与孕酮的兼容性完全不匹配。

所以说虽然引入溶剂对 CYP3A4 的结构和功能产生了一定影响，但这些影响在可接受范围内，不足以引起蛋白质显著的构象变化。此外，软件工具在结合位点预测方面表现出了一定的局限性，提示需要进一步验证和研究。

图一：CYP3A4 潜在结合位点的识别与验证流程

图二：不同初始蛋白构象下蛋白主链在溶剂盒和 TIP3P 水盒中的 RMSF 波动

RMSF 波动对比了三种独立模拟情况：(A) 无配体（apo），(B) 含配体 1（holo1），(C) 含配体 2（holo2）。

图三：由溶剂运动派生的五个配体通道

通道 2a, 2e, 2f, 4, 和溶剂通道分别显示为红色, 紫色, 橙色, 蓝色和青色。

图四：使用四种溶剂探针在 MixMD Probeview 中评级最高的位点

探针为 IPA（红色），NMA（橙色），IPH（绿色），和 PYR（蓝色）。图中(A)至(C)分别表示无配体模型（apo），含配体模型 1（holo1）及含配体模型 2（holo2）的溶剂密度图。

图五：无配体蛋白模型下，从 MixMD Probeview 派生的结合位点的溶剂分布

结合位点分别为：(A)位点 A 和位点 1，(B)位点 2，(C)位点 3，(D)位点 4，(E)位点 5，(F)位点 6。

图六：使用五种效应子进行的集成分子对接，导出的前 10 名构象的 Glide Gscore

效应子分别为：(A) alpha-naphthoflavone，(B) carbamazepine，(C) diazepam，(D) midazolam（中性形式），(E) midazolam（质子化形式），(F) progesterone。对接设置由蛋白模型和位点的缩写组合表示（例如，apo_S1 代表使用无配体结构作为蛋白模型，位点 1 作为网格盒）。

图七：cMD 模拟前后配体结合模式的构象变化

初始构象以半透明的三文鱼色棍状图示，最终构象以橙色棍状图表示，模拟中派生的关键残基以绿色棍状图表示。涉及的相互作用类型有氢键（红色虚线）、π-阳离子（青色虚线）和 π-π 相互作用（蓝色虚线）。

总结

研究利用混合分子动力学（MixMD）模拟揭示了 CYP3A4 的多个全新配体结合位点。

该研究使用 MixMD 技术对 CYP3A4 系统进行了长时间模拟，以探索其配体结合位点。通过延长模拟时间，溶剂探针能够进入蛋白质内部的大型结合腔，并识别结合位点。结果显示，长时间 MixMD 模拟不仅能够检测到蛋白质内部的潜在结合位点，还能同时观察到外部表面的结合位点。

通过与其他在线计算工具的对比分析，MixMD 在处理结构的灵活性方面展现出优越性，能够提供一致的预测结果。此外，研究还发现了两个未被报道的全新配体结合位点，位于 F-G 环之间，这表明这些新发现的位点可能通过变构效应影响活性位点的功能。

该研究不仅增进了对 CYP3A4 奇异代谢行为的理解，还强调了在药物设计中考虑这些新结合位点的重要性。尽管研究模型显示在单体受体模型中维持稳定的配体结合存在挑战，但这些新发现的位点为未来的药物开发提供了新的靶标。

• Feng, Y., Gong, C., Zhu, J., Liu, G., Tang, Y., & Li, W. (2024). Unraveling the Ligand-Binding Sites of CYP3A4 by Molecular Dynamics Simulations with Solvent Probes. Journal of Chemical Information and Modeling, 64(8), 3451–3464. https://doi.org/10.1021/acs.jcim.4c00089

• Data and code: https://github.com/m3g/packmol  

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