qRT-PCR计算方法(2^-△△Ct)与GraphPad作图:

文摘   2024-11-01 22:25   以色列  

免费资源:

一、国自然类:


1 2023历年国自然标书全文

3 国自然项目答辩PPT

5 标书写作模板

7 GraphPad 9安装包

2 2018-24年国自然清单

4 基金插图素材(可编辑)

6 近10年国自然标书全文

二、SCI生信+实验类:

1 160套SCI实验操作视频

3 Meta分析范文+教程

5 泛癌分析万能代码

7 130套SCI实验视频

9 单细胞数据挖掘课

11 统计分析万能模板

2 100个SCI实验Protocol

4 miRNA预测靶基因代码

6 动物实验操作视频汇总

GEO/TCGA数据挖掘课

10 SCI写作万能模板

三、科研绘图类:

PPT科研绘图素材合集

3 Adobe illustrator绘图素材

5 动物实验矢量图素材

7 PS修各种SCI实验图视频

资源共享群

PPT科研绘图插件VIP版

4 各种实验仪器矢量图素材

6 细胞实验矢量图素材

AI科研绘图视频课

10 亲交友微信群

一、今日推送:

1、滑动查看qPCR引物设计步骤:

qPCR现在已经成为大部分分子实验室的标配,无论是基因检测、基因定量、病原体检测、SNP分型等等实验,都涉及到qPCR技术。在整个qPCR技术中,引物设计是非常重要的一环,决定了扩增效率是否达标、扩增产物是否特异;最终决定我们的结果是否可用。


您是不是也在qPCR引物设计中不知所措:

如何使引物特异性最佳?

遇到多个转录本应该怎样设计引物?

有什么简单方法能一学就会?


在设计qPCR引物时,通常要留意以下几点:

GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……


这么多要注意的怎么办?!今天小编带大家一起设计qPCR引物,让qPCR引物设计成为你的绝杀技能。下面,我们以人的EGFR(Epidermal growth factor receptor,表皮生长受体因子)基因为例,设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物!


01

查询基因结果 

首先,通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构,这里要注意对比基因名称、种属,确保都要一致。




02

确定引物位置 

我们的目的是将不同的转录本都扩增出来,所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到,这个基因有多个不同的转录本,第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列(红框内的绿色小竖线)。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。 





03

找到mRNA的序列号 进入GenBank 

在该页面里继续往下拉,就能找到mRNA序列号,点击即可进入GenBank了。借助Highlight Sequence Features,我们可以快速确定外显子的位置。



04

确定引物位置 

点击Highlight Sequence Features后,浏览器的下方就会出现选项,选择查看exon,这样就能快速定位外显子的位置啦。我们确定了第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp。



确定位置后,点击Pick Primers,就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。



05

设计引物 

我们已经查到第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp,那在这个区间设计引物,才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意,qPCR的产物大小一般不超过300 bp,并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳,跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后,我们就可以点击Get Primers啦。



这时,NCBI就会弹出来告诉你,这样的参数选择会扩增到其他剪切变体,我们勾选不同的剪切变体并提交,就可以获得合适的引物对了! 



这些引物对的退火温度,都在60℃左右。根据实验目的,选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验,成功率还是相当高的呢!



06

引物特异性验证 

其实,Primer-Blast除了可以设计引物外,还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面,输入我们设计好的上下游引物,其它参数可以不调整,提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦,如果全部都显示在我们想要扩增的基因中,说明这对引物的特异性棒棒哒!



相当简单有木有啊~是不是感觉自己已经告别科研小白的身份,瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。


2、qPCR的+2^-△△Ct计算万能模板:

在临床上,比如我们收集了3个患者和3个正常人的样本(两组独立样本),然后做Wnt4基因和内参基因GAPDH的qRT-PCR定量,得到CT值。


接着我们要比较这个WNT4基因在哪个组里面表达高,哪个低。也就是目的基因减去内参基因,计算它们的2^-△△Ct,并且分析出有没有统计学意义。


那应该怎么做呢?今天我们给大家整理了无脑操作的:


“qPCR计算万能模板+GraphPad软件”

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第一步、计算2^-△△Ct:打开第一份模板,输入CT值(CT值是你自己机器上测得的哦,CT或者CP),自动得到2^-△△Ct,如下:



(a)Ct:表示的是循环阈值,基因和管家基因(内参,一般是β-Actin或者GAPDH或者α-tubulin等,具体内参根据组织或者细胞而定)有其对应的Ct值;

(b)△Ct:表示的基因Ct值减去管家基因Ct值(即:△Ct =Gene△Ct- Housekeeping gene Ct);

(c)△Ct平均值(对照组):一般选择对照组的△Ct的均值;△△Ct:基因的△Ct值减去参考Ct(即:△△Ct =△Ct- 对照组△Ct平均值);

(d)2^-△△Ct:即取底数为2,指数为-△△Ct即为(2^-△△Ct),在excel中输入方法(英文状态):“=power(2, -△△Ct)”;


第二步、差异分析并做图:统计方法的选择,不懂的同学可以收藏这张流程图),从上面我们知道是两独立样本t检验分析。所以,这里我们先安装graphPad软件:



一键安装,什么都不用管,就是永久免费使用的。安装好后有英文和中文两个版本:


随便你用。那安装好软件后我们就打开,然后输入数据:



输入数据后,我们选择非配对两独立样本t检验:



然后我们就知道有四颗星:


然后我们回到图形页面,选择个体图:



并且一键配色:



并且一键添加统计学P值:



这个时候我们的图就可以复制然后粘贴到PPT中用来汇报了,一家人整整齐齐:



然后老板想看你原始数据的时候,双击即可跳转出graphpad原始数据页面:



如果这个数据可以,那我们投SCI的时候,我们就可以在graphpad页面导出emf矢量图:



再把emf拖动到ai组图中:



就可以编辑任何一个元素,组装成SCI投稿需要的图啦:



好了,这一套资源都给大家整理好了,免费获取:


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此外,看下面这篇NC的论文,整合GWAS和eQTL数据,从SNP水平出发分析哪些基因的表达变化会导致某些疾病的发生就是一篇NC



非常简单。因为还很热,所以很好发。所以小编今天教大家一键完成这个孟德尔分析,得到:49个组织中任意基因的表达水平与任意疾病的因果关系,发一篇Nature。




小鼠实验都不用做了,直接就知道该组织中该基因增加是否会导致疾病的发生下面看操作:


一、snp提取:


先去(49个组织的eqtl数据,该数据来源于GTEX数据库,我们已经给大家处理好了,能直接读取和提取数据下载自己想要的组织的eqtl数据,随后将我们给大家的代码和该文件放在同一个文件夹下,如下:



打开代码后,一键运行(修改你的工作路径和读取文件名就行),运行完代码后就可以得到每个基因的eqtl数据,一个all_genen文件,和每一个基因会有一个文件夹(正常情况下,血液中会提取到1万多个基因有snp,也就是会有1万多个文件夹,我这里仅仅显示3个基因3个文件夹给大家看看),如下:



二、提取影响基因表达量的snp:


那我们提取了基因的snp之后,我们要知道哪些snp会影响该基因的表达量。如下(需要你修改工作路径哦):



这里使用连锁不平衡参数(R平方>0.2和遗传距离为100kb,有些SCI是用0.1,有些是0.2,所以我这里选用的0.2)筛选影响每个基因表达水平的SNP。一键运行后,你就会得到snp影响基因表达量的基因文件,如下示例A3GALT2_expo_rt.txt文件就是说明A3GALT2基因的SNP是可以影响A3GALT2表达量水平的(这只是示例,实际上基因snp能影响该基因表达量的应该有大几千个,运行时间大约为24小时,普通电脑也可以运行的):



这些_expo_rt.txt结尾的基因文件就是我们后面用来做孟德尔随机化分析的文件(我这里仅用A3GALT2_expo_rt.txt作为示例演示)。


二、孟德尔随机化分析:


接下来,我们要看影响了A3GALT2表达量的SNP能不能导致我们疾病的发生。对于疾病文件的选择,你可以从芬兰数据库中选取任意疾病做后续的分析(芬兰数据库R10的数据我们都给大家整理好了,一共2408种疾病,点击即可下载)。


我们从R10下载自己任意想要的疾病数据即可,比如我要下载上图里面的数据,复制链接到网页就自动下载了:



我这里以我们前面得到的A3GALT2_expo_rt.txt的SNP对心源性哮喘finngen_R10_ALLERG_ASTHMA.gz为例(我这里仅以这个基因为例,真实上你会得到几千个基因的文件夹,该代码是循环的,一键批量运行的):



一键运行代码,你就可以该血液中基因表达量增加是否会导致过敏性哮喘的发生



就搞定了,对于结果的解读,非常简单,如果你不懂。小编给你准备了这份中文文献:



一模一样的操作,他们只是做了lncRNA与肺腺癌的因果关系。有了我们这份代码和工具你可以做任何组织中任何基因与任何疾病的因果关系,你也可以照着模仿写作,结果出的好就是一篇5-10分的SCI。结果不好就跟上面一样发篇中文的。


好了,总结一下,你只要有了我们给大家分享的代码和工具就能天下无敌。你如果能一次性分析完(GTEX数据库中有49个组织,芬兰数据库R10中有2408个疾病,49乘以2408。一个组织一个疾病跑一次代码,你如果想一次性做出来,你需要跑117992次代码),我觉得发篇Nature都是可以的。



一键eqtl孟德尔随机化分析代码和工具免费分享给大家:


如下免费获取:

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二、资源免费送:

顶级CNS插图如下:



但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。


所以,今天小编给大家免费赠送:


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”


生物医学之家CNS插图素材部分截图如下:



这些素材都是用Adobe illustrator绘制的,打开后可以继续编辑修改,这些素材原价是9999元的,现在免费给大家送永久账户。如下免费获取永久VIP账户:


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免费发送1万个永久VIP账户,有了这个账号之后,你可以无限、永久下载生物医学之家的CNS插图素材。共有1万张素材,囊括了各种生物、人体组织、细胞、病毒、植物等。素材首页如下:



一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型,那就直接搜索鼠,有几百张小鼠插图就出现了:



有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图:



可以随意修改颜色:



也可以随意修改大小:



Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中,并对齐:



随后画一条线,示意要D369打药:



随后添加字体,这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。



最后保存和导出,一定要记得保存,保存就是矢量图了,以后还能修改。导出就是导出为图片,用来讲PPT或者投稿。



还在等什么?赶快免费获取账号呀,发SCI、作图的时候肯定用得着。


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还有,我们下载的素材,也可以右键取消分组:



然后修改任何一个你想要修改的元素,比如修改液体的颜色:



也可以将注射器放在背上,模拟皮下注射:



还可以将小鼠变为黑色:



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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞:



有了这些素材,分分钟就可以绘制如下这种高分插图:



三、各种Nature插图原图:



下载下来之后每个细微的元素都可以修改:




我们一共上传1万张Nature插图。大家赶紧获取永久VIP账户吧,投稿绘图的时候用得着:


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更多免费资源:

三、科研绘图类:

1 GraphPad绘图模板

50套R绘图万能代码

直装版PS+AI安装包

医学统计分析R版

9 单样本RNAseq分析

11 SnapGene序列比对

13 Endnnote安装包

15 R语言绘图模板

17 中文版RNAseq教程

19 Image J图片处理视频

21 更多资源在更新中.....

2 600套PPT模板

4Origin绘图模板

SPSS统计分析模板

8 铜铁死亡分析代码

10 m6A甲基化分析代码

12 qPCR计算模板

14 英文简历模板

16 R各种统计分析模板

18 46套生信分析代码

20 Sigma plot绘图软件和视频

四、生信和写作类:

1 ChIPqPCR引物设计

3 过表达引物设计

零代码复现6分SCI教程

零代码复现4分SCI教程

WGCNA分析课程

11 GO分析傻瓜式教程

13 GSEA分析傻瓜式教程

15 渐变火山图傻瓜式教程图

17 GEO+TCGA数据挖掘课

19 41GB的生信分析+实验资源

2 shRNA设计

4 Crispr-csa9素材

零代码复现5分SCI教程

8分SCI零代码复现步骤

10 超全生信数据库使用教程

12 KEGG富集分析教程

14 Meta分析范文+实操课

16 交集基因筛选高级教程

18 生信软件合集

辛苦整理,全文无任何广告!

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科研部
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