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今天为大家介绍的是来自Jarek Juraszek和Johannes P. M. Langedijk团队的一篇论文。人类偏肺病毒融合蛋白（hMPV Pre-F）的前融合构象对于引发最有效的中和抗体至关重要，是针对hMPV呼吸道感染的有效疫苗的首选免疫原。在这里，作者展示了F蛋白中的额外裂解事件使三聚体能够闭合并正确折叠。因此，作者对F蛋白进行了工程设计，使其能够进行双重裂解，从而能够在天然折叠的原聚体界面上筛选出稳定前融合构象的替代物。为了识别这些替代物，作者开发了一种人工智能卷积分类器，该分类器成功地预测了通常被基于物理的方法和视觉检查所忽视的复杂极性相互作用。通过结合额外的加工、界面区域的稳定化以及膜近端杆的稳定化，作者获得了一个不需要异源三聚体化结构域的前融合蛋白疫苗候选物，该蛋白表现出高表达量和热稳定性。冷冻电镜分析显示了包括杆部的完整胞外结构，以及新识别的被裂解的C末端与相邻原聚体的特定相互作用。重要的是，这种蛋白能够诱导高水平的交叉中和抗体反应，几乎完全保护棉鼠免受hMPV的攻击，使得这种高度稳定的双裂解hMPV前融合三聚体成为一个有吸引力的疫苗候选物。
人类偏肺病毒（hMPV）是一种属于Pneumoviridae科的包膜负链RNA病毒。hMPV是导致婴幼儿、老年人以及免疫系统受损者或有慢性病患者上下呼吸道感染的主要原因之一。hMPV融合蛋白F是一种存在于病毒表面的I类融合蛋白，对于病毒进入宿主细胞至关重要。它最初合成为一个单链前体F0，通过宿主细胞蛋白酶裂解成二硫键连接的F2和F1亚基，后者在其N末端携带融合肽。F通过从亚稳定的前融合（Pre-F）构象到高度稳定的后融合（Post-F）构象的巨大构象变化介导病毒和宿主细胞膜的融合。由于前融合（Pre-F）构象是中和抗体的靶点，因此有效hMPV疫苗的开发旨在稳定这种构象。
对于有效的疫苗来说，稳定病毒融合蛋白的前融合构象至关重要。实验数据表明，类似于RSV F三聚体的结构，三聚体的完全闭合需要额外的裂解。在人工智能模型的指导下，作者在hMPV F中引入了几种稳定的替代。该模型名为ReCaP（Residue Classification for Protein Design），是一种基于蛋白质结构的残差卷积神经网络，它用于识别和优化表现出高度置信氨基酸错误分类的位置。与生成模型或基于物理的方法相比，该模型在优化带电和溶剂介导的相互作用方面特别成功。在这里，作者展示了所得的hMPV F三聚体——在两个位置都有效裂解，无需异源三聚体化域即可三聚，并锁定在前融合闭合构象中——在小鼠中引发强效中和抗体反应，并在接受hMPV挑战的免疫棉鼠的上呼吸道和下呼吸道中提供保护。
hMPV F处理的分析
图 1
hMPV中和实验通常使用永生化细胞，并需要外源胰蛋白酶在F0的单碱性裂解位点进行裂解以实现有效感染。为了检测TMPRSS2是否也能实现这种裂解，作者将hMPV F0质粒单独或与编码人类TMPRSS2或furin的质粒共同转染入HEK293细胞中，以评估它们对加工过程的影响。Western blot（WB）分析显示，HEK293细胞中F0的加工不完全。与furin共同转染会减少F0的加工，而与TMPRSS2共同转染会增强F0的加工，但仍未能完成（图1A）。相反，从感染hMPV的完全分化的人类气道上皮细胞（hAECs）中收获的hMPV的WB分析显示，F0完全加工为F1和F2片段，这表明这些原代细胞可以在脱离的hMPV颗粒中完成F0的裂解，而无需额外酶的共同转染（图1B, C）。
hMPV F的裂解与F2截短
图 2
为了在Expi293F细胞等非天然环境中进行可溶性重组hMPV F的加工，作者设计了一个furin裂解位点，以实现类似天然的加工。作者设计了多个hMPV F变体，其中一个变体包含RSV F的p27结构域，该结构域已知能被furin在两个位点上非常有效地裂解。WB分析显示，无论是引入单个还是双重furin裂解位点，都未能实现hMPV F的完全裂解。只有整合了RSV F的p27结构域后，才获得了hMPV F蛋白的完全裂解（图2）。
由于F2可能会阻碍F三聚化，并且脱离的hMPV F的质谱分析尚未确认第二个裂解位点，因此研究了F2截短对重组蛋白的结构影响。为了测量对三聚化的影响，作者没有将F蛋白融合到典型的三聚化结构域，而是通过在杆区473、477或484位点引入大量疏水氨基酸来稳定第二个七肽重复（HR2）。因为三螺旋HR2杆在473位之前没有表现出经典的卷曲螺旋结构，而是形成类似于“倒置金字塔”的结构，其内部有空隙，因此作者选择在473和477位引入大疏水残基，以通过优化氨基酸侧链的包装来促进三聚化。此外，为了可能增加溶解度和稳定性，作者从RSV F杆部引入了四个带电残基，分别位于475、476、478和479位，其中475和479可以形成稳定的离子相互作用。
图 3
只有在F被裂解、F2截短且HR2杆区被稳定的情况下，SEC才能检测到三聚体表达。在473、477和484位点进行稳定化，或基于RSV F杆部引入其他替代物，导致三聚体F的形成显著增加，同时单体物种减少（图3A）。从单体到三聚体物种的这种转变与F变体的抗原性特征一致——根据SEC显示，含有更高比例三聚体物种的变体在Ø位点特异性ADI-61026的信号更强，而在三聚体界面或单体特异性MPV458的信号较弱。这表明，当F被裂解且F2被截短时，hMPV F可以形成闭合的三聚体构象。相比之下，裂解且HR2杆区稳定但未截短F2的变体表现出显著的MPV458结合，表明存在开放构象或单体物种。
为了验证最佳的F2截短，作者设计了一系列在F2 C末端进行系统性截短的hMPV F变体。每个变体都结合了HR2杆稳定化（VII）、E453Q替代以及在RSV p27结构域前的四个精氨酸（图3B）。hMPV-p27变体在Expi293F细胞中转染，并在细胞培养上清液中通过SEC检测三聚体表达，同时通过BLI评估与mAbs ADI-61026、MPV458和DS7的结合。具有更广泛F2截短的变体虽然表达量略低，但在SEC中显示出显著的三聚体峰（4.46分钟）并与特异性识别前融合构象的mAb ADI-61026结合更强，而非MPV458。这种结合特征表明，与具有较长F2 C末端的变体相比，截短的F2更有可能形成闭合的三聚体构象。
稳定前融合构象
为了预测可以提高hMPV F三聚体前融合构象稳定性的替代物，作者采用了两种不同的方法。
第一种方法使用了在Rosetta中实现的基于物理的固定主链或耦合移动设计算法。该算法是一种计算方法，用于设计蛋白质界面，利用蒙特卡罗模拟技术，通过对相互作用蛋白质的侧链和主链角度进行相关变化的迭代优化，帮助准确建模蛋白质相互作用过程中发生的复杂运动和结构调整，从而得出更可靠的预测和设计。
图 4
第二种方法涉及作者开发的一种基于AI分类器的非物理方法。这个分类器建立为一个残差卷积神经网络（图4A），旨在基于体素化的原子微环境预测掩盖的氨基酸。该模型在蛋白质数据库（PDB）的大量蛋白质结构数据集上训练，有效使其能够识别典型的、稳定的和相对良好的蛋白质结构。在作者的尝试中，作者决定将可用给模型的信息限制到最小，仅使用对应碳、氧、氮和硫位置的4个原子通道。
通过SEC分析转染了hMPV-F-trunc变体的Expi293F细胞上清液中的三聚体含量，并通过八肽测量使用ADI-61026检测前融合F的含量（图4B）。与之前的筛选相似，观察到了三聚体含量与ADI-61026结合之间的相关性。AI/ML预测的替代物相比其他方法表现出显著更高的三聚体表达增加。特别是位于融合肽螺旋弯曲处的V112R，与之前描述的成功140-147二硫键相比，显示出非常强的三聚体表达增加。
另一个杆部区域稳定的例子是S445Y替代物，其通过在界面上填充浅口袋与HR2相互作用，并与F464相互作用。接下来，测试了选定的稳定替代物V112R、D209E和E453P（这些替代物稳定了原聚体界面）以及AI模型预测的填充空腔的V231I替代物对表达和稳定性的影响。对于所有组合，保守替代D209E相对于亲本构建体表现出非常强的稳定效应，即使在仅含D209E替代的情况下，三聚体在63°C的30分钟热处理后仍然保持稳定。所有四种稳定替代物的组合导致表达最高的最稳定F三聚体（图4C）。
稳定的双裂解hMPV F保持闭合的三聚体前融合构象
为了评估双重裂解对前融合（Pre-F）三聚体的影响，作者对完全裂解且稳定的闭合前融合三聚体以及一个带有R102Q、V112R、S149Y、V231I、H368N和E435P且融合了C末端foldon（MPV-foldon）的未裂解开放hMPV前融合变体进行了纯化和分析。
图 5
作者对两种不同的双重裂解hMPV前融合三聚体进行了纯化：一种是带有V112R、D209E、V231I、H368N和E453P的前融合变体，标记为MPV-2c；另一种是在不同区域带有两个额外稳定替代物（S149Y和N404P）的变体，标记为MPV-2c2。通过SDS-PAGE确认后两者的完全裂解，SEC-MALS显示所有三聚体在预期保留时间的对称峰且具有正确的分子量（图5A, B）。对于闭合的三聚体，冷冻/解冻稳定性更高，而DSF显示开放未裂解三聚体的主熔化事件对应的Tm50为67.1°C，MPV-2c为71.8°C，MPV-2c2为73.9°C，与二硫化物稳定的前融合三聚体相比，其热稳定性更强（图5C）。使用mAb DS7、广泛结合F的单克隆抗体（mAbs）ADI-18992和ADI-14448、抗界面mAb MPV458和前融合特异性mAb ADI-61026，通过BLI评估蛋白质的构象（图5D）。为了展示稳定策略对其他hMPV株的普遍适用性，MPV-2c设计应用于B2株和禽类MPV。野生型hMPV F B2仅表现出单体表达和低稳定性，而稳定变体显示出高水平的三聚体表达和72.7°C的熔化温度，甚至略高于A1变体（图5E, F）。使用识别后融合或前融合到后融合中间构象的特异性DS7、三聚体界面特异性MPV458和Ø位点特异性ADI-61026的BLI显示，稳定的hMPV F B2三聚体处于前融合构象并且完全闭合，而野生型B2三聚体显示与DS7和MPV458结合（图5G）。此外，野生型禽类MPV F仅表现出单体和低表达水平，而稳定变体显示F表达显著增加，主要以三聚体形式存在（图5H）。
稳定的hMPV前融合冷冻电镜结构
为了更好地理解裂解、F2截短和替代物在稳定hMPV Pre-F蛋白中的作用，作者使用单颗粒冷冻电镜确定了双裂解前融合三聚体的结构。为了详细观察F2的C末端，作者重点研究了两个变体，MPV-2c含有前面提到的额外furin位点（90RRRR），和MPV-2cREKR含有一个与天然序列更相似的替代furin位点（91REKR）。纯化的hMPV Pre-F蛋白直接应用于冷冻电镜网格。原始电镜图像显示没有聚集的颗粒，二维分类确认仅存在三聚体形式，未观察到单体形式。通过施加C3对称性分离并细化了一组稳定的前融合三聚体颗粒。
图 6
作者的结构显示了长HR2到达残基Gly487，使其成为迄今为止最完整的hMPV结构（图6A）。在HR2中L473W和S477F的替代在三个螺旋的交界处引入了紧凑的芳香簇（图6B）。在此簇中，苯丙氨酸残基与色氨酸形成T形芳香相互作用。此外，Q476K覆盖其暴露的苯基，并与色氨酸的吲哚环形成π-阳离子相互作用，有助于结构的整体稳定性。
与先前的结构一致，融合肽与HR2及相邻原聚体的II型β-夹心结构结合。融合肽与相邻原聚体的相互作用主要由F103和I108介导，但这些相互作用显示出相当不理想的侧链包装，侧链之间存在小空腔（图6D）。在野生型结构中，D209羧酸盐、R205胍基和L219主链之间存在空腔。此位点可能容纳了一个水分子以介导与D209羧基的相互作用。D209E替代更有效地填补了这一空间，维持了局部电荷平衡，与L219的NH基团形成氢键，并与R205的胍基建立极性接触（图6C）。
除了集中于三聚体界面的新型前融合稳定替代物的结构细节，带有截短F2 C末端的双裂解三聚体在没有foldon的情况下揭示了一些以前发布的结构中未见的增加的原聚体间相互作用的独特特征。(I) HR2中的替代物改善了三聚体界面的相互作用，从而得出完整三螺旋杆的结构解释。(II) 在N172处的延伸EM密度表明可能存在一个额外的聚糖残基，可能在顶点形成一个聚糖“冠”，并与相邻原聚体形成潜在的相互作用。(III) 新型F2 C末端与相邻原聚体的特定相互作用。这包括L89和R91与V38、L243、H332、R329、F334的疏水相互作用，L89主链与N247之间的氢键，以及R91与D280之间的盐桥（图6E）。
稳定的前融合hMPV F三聚体引发中和和保护性免疫反应
图 7
为了评估设计的hMPV前融合作为潜在疫苗候选者的效果，作者比较了在初次免疫的小鼠中，未裂解（MPV-foldon）和裂解的前融合变体（MPV-2c和MPV-2c2）引发的结合和中和抗体滴度（图7A, B）。与未裂解变体相比，使用ASO1B佐剂的裂解前融合变体免疫的小鼠产生了显著更高水平的hMPV前融合结合抗体和中和抗体。
为了评估稳定的前融合蛋白增强hMPV预先存在免疫反应的能力，小鼠被hMPV A2鼻内感染，并在12周后用15 μg MPV-2c进行免疫。在免疫后长达12周的测量中，单次免疫未加佐剂的前融合蛋白显著增强了前融合结合抗体和中和抗体滴度（图7C, D）。通过hMPV棉鼠挑战模型评估MPV-2c对hMPV的保护能力。棉鼠以3周间隔免疫两次，分别使用MPV-2c和AS01B佐剂或Post-F和AS01B佐剂，并在最后一次免疫后3周进行hMPV A2的鼻内感染。前融合免疫在挑战前血清中引发了强烈的病毒中和抗体滴度，而没有疫苗剂量依赖效应。相比之下，Post-F免疫动物的中和抗体滴度较低（图7E）。
在hMPV挑战后，假免疫动物表现出明显的鼻部和肺部病毒载量，而在第0天通过鼻内预先暴露于hMPV的动物则完全受到保护。免疫MPV-2c的动物在上呼吸道和下呼吸道完全受到保护，除了1只动物在免疫后未能产生抗体滴度。相比之下，免疫Post-F的动物在肺部完全受到保护，而鼻部仅有部分保护（图7F, G）。此外，作者使用更灵敏的RT-PCR方法评估了肺部病毒载量，再次观察到免疫前融合的动物的病毒载量显著减少，而Post-F免疫动物的减少较小（图7H）。相关性分析显示RT-PCR测量的肺部病毒载量与挑战前血清中和抗体滴度之间存在明显的负相关（图7I）。
讨论
目前尚无疫苗或特定抗病毒治疗可以预防hMPV感染。本文展示了一种通过AI指导设计的双裂解、稳定且闭合的hMPV Pre-F三聚体，该蛋白不含异源三聚体化域，表达水平高，在棉鼠中能诱导强保护作用。AI模型ReCaP通过识别异常微环境并预测稳定替代物（如V112R和D209E），有效增强Pre-F三聚体稳定性和表达。冷冻电镜结构显示双裂解三聚体的独特特征，支持F2 C-末端截短假说。此稳定的Pre-F三聚体能在动物模型中引发广泛的中和抗体，是hMPV疫苗研发的有力候选者。
编译 | 于洲
审稿 | 曾全晨
参考资料
Bakkers M J G, Ritschel T, Tiemessen M, et al. Efficacious human metapneumovirus vaccine based on AI-guided engineering of a closed prefusion trimer[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 6270.
