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震惊！上海华山医院外科医学博士杀妻：
事件发生在2023年4月1日，复旦大学附属华山医院医生周某某将其护士妻子徐某某杀害，知情人透露，周某某因纠纷在家中掐其妻子脖子，120到场后确认徐某某死亡！
据当时华山医院一名医生称：
犯罪嫌疑人周某某37岁，外科学博士，毕业于复旦大学上海医学院，目前是华山医院普外科的主治医生，主要擅长胆道相关良恶性疾病的诊治。
死者徐某某今年仅32岁，是上海本地人，夫妻二人育有一个女儿。
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另据最新消息透露，案发时家中共有四人，分别是夫妻二人、女儿及孩子外婆。
案发后，徐翔蕾的母亲发现女儿被害后立即报警。据事发小区物业的一名工作人员称，死者的母亲已经带着死者的女儿连夜搬离房子，称再也不会回来了。
网友们也纷纷猜测这位男医生杀人的真正原因，有网友直言肯定是这位年轻漂亮的护士妻子出轨了，流言蜚语传到同在一家医院的医生丈夫听到，所以他忍无可忍，在家里面发生了口角冲突，然后一气之下掐死老婆。
但另有知情网友称，凶手一直打算想要二胎就想要个儿子，因为他们只有一个女儿，而且护士妻子也已经怀孕，自己正满心欢喜地期待这个宝贝的到来，却发现妻子背着自己偷偷地把腹中的胎儿打掉，所以只能背着还在家中岳母和女儿，把妻子拉到卫生间问个明白，在交流的过程当中情绪失控，于是下死手掐死妻子。
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听到女子说要把孩子拿掉，凶手就怀疑女子肚子里怀的不是自己的孩子，肯定是女子出轨了怕把孩子生下来。一气之下就把女子掐死了！
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尽管没有警方的证实，但网友们却从死者母亲的首次发声里得到答案。
死者的母亲发现女儿被害后，立刻报警，让警方控制住凶手女婿，之后自己便发了一条朋友圈，告知亲朋好友女儿去世的消息。
而对女儿死因的描述，她用的是“英年早逝”4个字，这确实让很多人感到很奇怪，为何没有直接说明女儿是被自己的丈夫杀害，就算是英年早逝也应该给出具体死因，比如说车祸或者是突发疾病。
2023年4月1日10时50分，新龙路某小区内发生一起刑事案件，民警迅速到场将犯罪嫌疑人周某某（男，37岁）控制。经查，周某某因家庭矛盾与妻子徐某某发生冲突后，将徐某某杀害。目前，周某某已被依法刑事拘留，案件正在进一步侦办中。
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一朝不满，就送上绝路。不说是丈夫了，就是医生身份，哪怕能力有限，做不到救死扶伤，也绝对是医者父母心，心里总该有一份仁慈，绝不至于杀心至此，对自己朝夕相处的枕边人，对自己终身相托的人下此狠手。可见，论起杀伤力，没有比枕边人更让人防不胜防的了。
当然，这只是个案，不具有普遍性和代表性。只不过这起案件中的人碰巧是医护人员罢了。
那么，这是否也给我们提了个醒，从事高压力高强度行业的人，特别是医护人员，会不会更容易产生心理和情绪管理方面的问题？是否需要建立个制度，对他们进行定期心理评估，疏导调理？这其实也是对他们的一种关爱和尊重！
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新年快乐，很多同学都留言说需要国自然基金标书全文，写的时候可以参考和模仿。那我们把今年培训的国自然内部资料一次性免费发送给大家（新手完全可以按照别人中过的标书模仿着写，老手也可以参考别人标书中的套路是怎么回事）:
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一、2018-2024国自然中标项目清单:
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比如生科院和医学院的：
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如医学部有1万左右：
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二、国自然中标项目标书全文:
这都是已经中标的标书全文，对我们参考非常有用，部分截图如下：
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（模糊截图，高清请下载）
三、几十套杰青、优青申报PPT（可编辑）
对于申报杰青、优青、长江的科研人员，一份已中的PPT模板可以很好的参考，思路逻辑格式等等：
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比如优青答辩PPT：
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再比如杰青的答辩：
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好了，这些资料我们都已经打包好了放在百度云了，大家赶紧保存到自己的百度云中吧，非常有用。
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CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌和古细菌中天然适应性免疫机制的基因编辑工具。它利用Cas9蛋白和一种向导RNA（sgRNA）结合DNA靶点，从而实现对特定基因的敲除或敲降。其原理如下：CRISPR-Cas9通过向导RNA（sgRNA）识别靶基因，并由Cas9蛋白切割靶DNA产生双链断裂。当sgRNA引导Cas9蛋白到达靶位点后，Cas9会检测靶位点下游是否存在特定的PAM（通常为5'-NGG-3'），且对PAM序列上游第3个碱基和第4个碱基之间进行切割：随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ，易于引入插入或缺失突变（indels），导致靶基因编码框移位或功能丧失，达到敲除或敲降的目的。）修复引入突变，导致基因失活。或通过同源定向修复（HDR，如果提供一个模板DNA，细胞可能利用该模板精确修复切口，用于定点突变或插入序列。）进行精确编辑。我这里举一个例子，如下，比如你的DNA如下，你的sgRNA是靶向GGGCAAGAACGGGGTATTCG：![]()
那后面的TGG就是PAM序列。cas9蛋白会对PAM序列上游3和4碱基（即TT之间）之间进行切割。那切割之后就是----GGGCAAGAACGGGGTAT TCG----。同时切开后细胞会对DNA进行NHEJ修复。这个时候切口两边的T都可能丢失掉。随后最后你的细胞的DNA最终变为了GGGCAAGAACGGGGTATCG，减少了一个T，也就是发生了移码突变，你的DNA就不会转录出RNA，也不会翻译得到蛋白质了，也就是基因敲除。这只是你筛选的单细胞的一种可能，可能你筛选了50个单细胞，长到6cm皿后做PCR检测序列的时候可能有很多种可能：![]()
目前，比较商业化的CRISPR-Cas9质粒是57818质粒：![]()
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这个质粒带有EGFP荧光，sgRNA酶切位点和Cas9蛋白。这个质粒一般是通过BsmBI酶切两个位点切开后，将目的sgRNA替换上去，从而完成目的CRISPR-Cas9质粒的构建：![]()
下面我们教大家如何构建sgRNA质粒（已经验证过的，放心使用）。首先是sgRNA设计(www.swyxzj.com，生物医学之家)：![]()
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那，GAGACGTGCGAGAAACTCAA是靶向的DNA序列，靶向的是WNT4基因的第二个外显子，非常不错，不过最理想的是靶向第一个外显子，这样我们移码突变的效果最好。最后我们需要订购的oligo就是(两边是bsmbi连接序列，所以下面这个序列是万能序列，你只要替换中间的sgRNA序列就行，因为酶切位点连接位点是一样的)：![]()
两条oligo，订购的时候记得告诉公司，每一条oligo都需要5端磷酸化（因为有了这个修饰，我们后面才能连接到切开的57818质粒上，没有磷酸化就不能连接或者说连接效率低下）。为了方面做好记录，我们可以将这个sgRNA模拟出来，如下用snapgene,点击action---anneal oligo:
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那有个这两个片段，我们就可以模拟最后构建好的57818-WNT4sgRNA质粒，如下：
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点击action-insertion cloning--insert fragment:
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最后这就是我们的完整质粒啦：
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OK，以上为理论，现在我们要开始讲实验啦。首先是订购的单链oligo退火形成双链，体系如下：![]()
GE100007是货号，95到25度，每下降5度后呆5分钟，一直到25度，大约是70分钟。
随后是57818的bsmbi酶切，要注意bsmbi这个酶需要新鲜的DTT，同时这两个位点太近了，所以需要加入FastAP防止自连。37度酶切1.5小时。然后65度20分钟停止酶切和75度5分钟抑制FastAP活性，随后将酶切产物跑胶1.5小时，胶回收，最后测DNA的浓度：
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最后是连接，首先将退火的sgRNA双链稀释200倍后用于下面的实验。加入的体系如下（ps：这个体系也是万能体系，反正就是加入100ng的酶切空载，所以你需要修改的就是5.6ul这个数字，根据你自己的来）：
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16度酶切16小时，65度10分钟终止酶切。最后就是转化，将质粒转化到大肠杆菌中。从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞DH5a 50uL，室温下置于冰盒上解冻5-10分钟，标记;向感受态细胞中加入5µl的质粒，置于4℃冰箱中,冰浴30min;在42℃水浴锅中热激90s，然后立即在冰盒上放置2min；每管加450µl LB培养基，37℃摇床震荡,220rpm×45min；取100µl 转化液加入对应抗性（这里是AMP+,氨苄抗性）的平板中，涂匀液体；将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。![]()
最后就是挑取单克隆摇均提取质粒后送公司测序，给公司质粒，并告诉公司用U6-F或者LKO.15测序就行，一般测一个循环1000bp左右：![]()
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好了关注我们吧，下次我们教大家用这个质粒包病毒，病毒感染细胞哦。此外，今天，我们要给大家免费发送：
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基因表达水平检测PCR，qPCR，WB，基因敲降shRNA，基因敲除sgRNA，细胞转染，抗体制备，流式，测序，蛋白互作IP/COIP，ChIP，磷酸化WB，包病毒等一次性通通学会，还有很多经验的教学也是非常重要，比如你知道做PCR的时候GC含量很高就很难PCR出来，那其实现在商家早就解决了这种问题， 比如NEB公司的NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix，80%的GC含量我都PCR出来了，做了20个样，每个都P出来了。课程目录如下：
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总之，系统性的学习比到处百度好的多。
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一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型，那就直接搜索鼠，有几百张小鼠插图就出现了：
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有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图：
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可以随意修改颜色：
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也可以随意修改大小：
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Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中，并对齐：
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随后画一条线，示意要D369打药：
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随后添加字体，这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。
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最后保存和导出，一定要记得保存，保存就是矢量图了，以后还能修改。导出就是导出为图片，用来讲PPT或者投稿。
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然后修改任何一个你想要修改的元素，比如修改液体的颜色：
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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞：
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有了这些素材，分分钟就可以绘制如下这种高分插图：
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三、各种Nature插图原图：
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下载下来之后每个细微的元素都可以修改：
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