常用内参种类/如何选择合适的内参?

文摘   2025-01-01 23:51   美国  

免费资源:

一、国自然类:


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国自然项目答辩PPT

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7 GraphPad 9安装包

2018-24年国自然清单

4 基金插图素材(可编辑)

6 近10年国自然标书全文

二、SCI生信+实验类:

1 160套SCI实验操作视频

3 Meta分析范文+教程

5 泛癌分析万能代码

7 130套SCI实验视频

9 单细胞数据挖掘课

11 统计分析万能模板

2 100个SCI实验Protocol

4 miRNA预测靶基因代码

6 动物实验操作视频汇总

GEO/TCGA数据挖掘课

10 SCI写作万能模板

三、科研绘图类:

PPT科研绘图素材合集

3 Adobe illustrator绘图素材

5 动物实验矢量图素材

7 PS修各种SCI实验图视频

资源共享群

PPT科研绘图插件VIP版

4 各种实验仪器矢量图素材

6 细胞实验矢量图素材

AI科研绘图视频课

10 亲交友微信群


一、今日推送:

常用内参种类/如何选择合适的内参?:

图上蓝色字体标注为实验室比较常用的内参


1、全细胞:

β-actin:

肌动蛋白,细胞骨架蛋白。在各组织和细胞中的表达相对恒定,它广泛分布于细胞质内,表达量非常丰富。

➡️不适用情况:

细胞生长条件的改变以及与胞外基质组分的相互作用都可能会影响actin合成,另外脂肪组织中β-actin含量少。


GAPDH:

甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,表达相对恒定,且很少受外部诱导物的影响。

➡️不适用情况:

某些生理因素,如缺氧、糖尿病、肿瘤,会影响GAPDH表达。


β-tubulin:

微管蛋白,细胞骨架蛋白,表达通常不会发生改变。

➡️不适用情况:

抗微生物和抗有丝分裂药物使用可能会影响tubulin表达。


2、细胞核:

Lamin B1:

核纤层蛋白B1,是核纤层的结构部件用于支撑核被膜,也参与细胞周期中的核被膜解体和再形成。(核膜内参)

➡️不适用情况:

没有核被膜的样本,凋亡样本、胚胎干细胞也不适合Lamin B1。


Histone-H3:

组蛋白H3,是真核生物中负责染色体纤维核小体结构的五个主要组蛋白之一,常用作核内参勘误。


3、线粒体:

VDAC1:

电压依赖性阴离子通道蛋白1,是线粒体外膜上一种重要的跨膜蛋白,主要调控线粒体通透性和细胞能量代谢。

COXIV:

细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ亚型1,是线粒体电子传递中的末端氧化酶,因此常作为线粒体的内参。

HSP60:

属于伴侣蛋白家族,在维持线粒体蛋白质稳态平衡方面起重要作用,可促进蛋白输入和组装。


4、细胞膜

ATP1A1:

钠/钾离子转运ATP酶α1肽[或称Na(+)/K(+) ATPase 1],是膜结合酶Na+/K+-ATP的催化成分。作为普遍表达的膜蛋白,通常用作质膜蛋白的标记或内部控制。


5、全血/血浆/血清

Albumin:

白蛋白,是血浆中最丰富的蛋白质,因此作为内参时需注意上样量。

Transferrin:

转铁蛋白,是血浆中主要的含铁蛋白,顾名思义负责运载铁。

➡️不适用情况:

Transferrin表达状况受某些疾病状态和治疗的影响,比如视黄酸,因此在疾病模型中需要注意选择。


那么如何选择合适的内参呢?

1、目的蛋白分子量

选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD左右。

2、目的蛋白表达部位

➡️有些UU提取蛋白会选择胞浆、胞核分开提取,不提取总蛋白。β-actin在胞浆中表达高效稳定,而总蛋白主要成分就是胞浆蛋白,所以β-actin可以作为总蛋白的内参。

➡️理论上细胞核内不表达β-actin,所以不能用于核蛋白内参。内参自当选择与目的蛋白表达部位相同的蛋白才能有说服力。

胞浆和全细胞蛋白:

β-actin、GAPDH、Tubulin等;

胞核蛋白:PCNA、Histone H3等;

核膜蛋白:Lamin B等;

线粒体蛋白:COX IV、VDAC1等。


3、组织特异性

没有一种内参适用于所有组织和细胞,需根据具体情况进行选择。如:

‼️1、在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。

‼️2、不同组织的细胞结构会有差异性,如脑组织的 tubulin 的表达会高一些,而 actin 的表达量可能会低一些。再比如,骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化,这种情况可以选择GAPDH。

‼️3、缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达,不适合做内参。

‼️4、在加入抗癌和真菌药物时,tubulin表达受影响,不适合做为内参。

‼️5、血红细胞(因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性)样本就不适合常用内参。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

‼️6、做各种分泌液样本的时候,如血浆,乳汁,组织液等,常用内参不适合。由于没有完整的细胞结构,所以只能选择一些分泌蛋白作为内参,或者采用其他方式作为内参。

‼️7、做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,选择结构蛋白作为内参,如Actin和Tubulin,因为 GAPDH 是代谢类蛋白,表达量有可能会受到诱导处理的影响。


很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的,不同的公司选择的片段不一样。

以最常用的β-actin为例,有的公司选择N端,有的选择C端。选用N端的抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C端的抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”,就是由于抗体选择不对造成的。因此各位盆友们需要了解清楚再剁手买哦~🥳

(下滑查看更多)


CRISPR-Cas9系统是一种基于细菌和古细菌中天然适应性免疫机制的基因编辑工具。它利用Cas9蛋白和一种向导RNA(sgRNA)结合DNA靶点,从而实现对特定基因的敲除或敲降。其原理如下:

CRISPR-Cas9通过向导RNA(sgRNA)识别靶基因,并由Cas9蛋白切割靶DNA产生双链断裂。当sgRNA引导Cas9蛋白到达靶位点后,Cas9会检测靶位点下游是否存在特定的PAM(通常为5'-NGG-3'),且对PAM序列上游第3个碱基和第4个碱基之间进行切割:


随后,细胞通过非同源末端连接(NHEJ,易于引入插入或缺失突变(indels),导致靶基因编码框移位或功能丧失,达到敲除或敲降的目的。)修复引入突变,导致基因失活。

或通过同源定向修复(HDR,如果提供一个模板DNA,细胞可能利用该模板精确修复切口,用于定点突变或插入序列。)进行精确编辑。

我这里举一个例子,如下,比如你的DNA如下,你的sgRNA是靶向GGGCAAGAACGGGGTATTCG:

(snapgene软件安装包点击下载)

那后面的TGG就是PAM序列。cas9蛋白会对PAM序列上游3和4碱基(即TT之间)之间进行切割。那切割之后就是----GGGCAAGAACGGGGTAT     TCG----。同时切开后细胞会对DNA进行NHEJ修复。这个时候切口两边的T都可能丢失掉。随后最后你的细胞的DNA最终变为了GGGCAAGAACGGGGTATCG,减少了一个T,也就是发生了移码突变,你的DNA就不会转录出RNA,也不会翻译得到蛋白质了,也就是基因敲除。这只是你筛选的单细胞的一种可能,可能你筛选了50个单细胞,长到6cm皿后做PCR检测序列的时候可能有很多种可能:


目前,比较商业化的CRISPR-Cas9质粒是57818质粒:


这个质粒带有EGFP荧光,sgRNA酶切位点和Cas9蛋白。这个质粒一般是通过BsmBI酶切两个位点切开后,将目的sgRNA替换上去,从而完成目的CRISPR-Cas9质粒的构建:


下面我们教大家如何构建sgRNA质粒(已经验证过的,放心使用)。首先是sgRNA设计(www.swyxzj.com,生物医学之家):


那,GAGACGTGCGAGAAACTCAA是靶向的DNA序列,靶向的是WNT4基因的第二个外显子,非常不错,不过最理想的是靶向第一个外显子,这样我们移码突变的效果最好。最后我们需要订购的oligo就是(两边是bsmbi连接序列,所以下面这个序列是万能序列,你只要替换中间的sgRNA序列就行,因为酶切位点连接位点是一样的):


两条oligo,订购的时候记得告诉公司,每一条oligo都需要5端磷酸化(因为有了这个修饰,我们后面才能连接到切开的57818质粒上,没有磷酸化就不能连接或者说连接效率低下)。为了方面做好记录,我们可以将这个sgRNA模拟出来,如下用snapgene,点击action---anneal oligo:


那有个这两个片段,我们就可以模拟最后构建好的57818-WNT4sgRNA质粒,如下:


点击action-insertion cloning--insert fragment:



最后这就是我们的完整质粒啦:



OK,以上为理论,现在我们要开始讲实验啦。首先是订购的单链oligo退火形成双链,体系如下:


GE100007是货号,95到25度,每下降5度后呆5分钟,一直到25度,大约是70分钟。

随后是57818的bsmbi酶切,要注意bsmbi这个酶需要新鲜的DTT,同时这两个位点太近了,所以需要加入FastAP防止自连。37度酶切1.5小时。然后65度20分钟停止酶切和75度5分钟抑制FastAP活性,随后将酶切产物跑胶1.5小时,胶回收,最后测DNA的浓度:


最后是连接,首先将退火的sgRNA双链稀释200倍后用于下面的实验。加入的体系如下(ps:这个体系也是万能体系,反正就是加入100ng的酶切空载,所以你需要修改的就是5.6ul这个数字,根据你自己的来):


16度酶切16小时,65度10分钟终止酶切。最后就是转化,将质粒转化到大肠杆菌中。从-80℃冰箱中取出对应的感受态细胞DH5a 50uL,室温下置于冰盒上解冻5-10分钟,标记;向感受态细胞中加入5µl的质粒,置于4℃冰箱中,冰浴30min;在42℃水浴锅中热激90s,然后立即在冰盒上放置2min;每管加450µl  LB培养基,37℃摇床震荡,220rpm×45min;取100µl 转化液加入对应抗性(这里是AMP+,氨苄抗性)的平板中,涂匀液体;将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。


最后就是挑取单克隆摇均提取质粒后送公司测序,给公司质粒,并告诉公司用U6-F或者LKO.15测序就行,一般测一个循环1000bp左右:


等你的测序结果一回来就如下比对即可:


好了关注我们吧,下次我们教大家用这个质粒包病毒,病毒感染细胞哦。此外,今天,我们要给大家免费发送:


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总之,系统性的学习比到处百度好的多。


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那我们把今年培训的国自然内部资料一次性免费发送给大家(新手完全可以按照别人中过的标书模仿着写,老手也可以参考别人标书中的套路是怎么回事):


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一、2018-2024国自然中标项目清单:



比如生科院和医学院的:



如医学部有1万左右:



二、国自然中标项目标书全文:


这都是已经中标的标书全文,对我们参考非常有用,部分截图如下:


(模糊截图,高清请下载)


三、几十套杰青、优青申报PPT(可编辑)


对于申报杰青、优青、长江的科研人员,一份已中的PPT模板可以很好的参考,思路逻辑格式等等:



比如优青答辩PPT:



再比如杰青的答辩:



好了,这些资料我们都已经打包好了放在百度云了,大家赶紧保存到自己的百度云中吧,非常有用。



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顶级CNS插图如下:



但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。


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一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型,那就直接搜索鼠,有几百张小鼠插图就出现了:



有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图:



可以随意修改颜色:



也可以随意修改大小:



Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中,并对齐:



随后画一条线,示意要D369打药:



随后添加字体,这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。



最后保存和导出,一定要记得保存,保存就是矢量图了,以后还能修改。导出就是导出为图片,用来讲PPT或者投稿。



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还有,我们下载的素材,也可以右键取消分组:



然后修改任何一个你想要修改的元素,比如修改液体的颜色:



也可以将注射器放在背上,模拟皮下注射:



还可以将小鼠变为黑色:



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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞:



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三、各种Nature插图原图:



下载下来之后每个细微的元素都可以修改:




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