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你可以完成qPCR引物设计+Blast+2^-△△Ct计算+GraphPad柱形图绘制，绘制符合SCI组合图要求的高清美图：
一、qPCR引物设计+引物特异性检验
您是不是也在qPCR引物设计中不知所措：
如何使引物特异性最佳？
遇到多个转录本应该怎样设计引物？
有什么简单方法能一学就会？
在设计qPCR引物时，通常要留意以下几点：GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……
这么多要注意的怎么办？！今天小编带大家一起设计qPCR引物，让qPCR引物设计成为你的绝杀技能。下面，我们以人的EGFR（Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！
首先，通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。
我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到，这个基因有多个不同的转录本，第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列（红框内的绿色小竖线）。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。
在该页面里继续往下拉，就能找到mRNA序列号，点击即可进入GenBank了。借助Highlight Sequence Features，我们可以快速确定外显子的位置。
点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看exon，这样就能快速定位外显子的位置啦。我们确定了第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp。
确定位置后，点击Pick Primers，就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。
我们已经查到第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp，那在这个区间设计引物，才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意，qPCR的产物大小一般不超过300 bp，并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳，跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后，我们就可以点击Get Primers啦。
这时，NCBI就会弹出来告诉你，这样的参数选择会扩增到其他剪切变体，我们勾选不同的剪切变体并提交，就可以获得合适的引物对了！
这些引物对的退火温度，都在60℃左右。根据实验目的，选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验，成功率还是相当高的呢！
其实，Primer-Blast除了可以设计引物外，还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面，输入我们设计好的上下游引物，其它参数可以不调整，提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都显示在我们想要扩增的基因中，说明这对引物的特异性棒棒哒！
相当简单有木有啊～是不是感觉自己已经告别科研小白的身份，瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。
二、qPCR的2^-△△Ct计算+作图：
在临床上，比如我们收集了3个患者和3个正常人的样本（两组独立样本），然后做Wnt4基因和内参基因GAPDH的qRT-PCR定量，得到CT值。
接着我们要比较这个WNT4基因在哪个组里面表达高，哪个低。也就是目的基因减去内参基因，计算它们的2^-△△Ct，并且分析出有没有统计学意义。
第一步、计算2^-△△Ct：先打开第一份模板，输入CT值（CT值是你自己机器上测得的哦，CT或者CP），自动得到2^-△△Ct。这个模板可以让你对照组2^-△△Ct变为1，所以你就知道实验组增加/减少了多少倍，如下：
（a）Ct：表示的是循环阈值，基因和管家基因（内参，一般是β-Actin或者GAPDH或者α-tubulin等，具体内参根据组织或者细胞而定）有其对应的Ct值；
（b）△Ct：表示的基因Ct值减去管家基因Ct值（即：△Ct =Gene△Ct- Housekeeping gene Ct）；
（c）△Ct平均值（对照组）：一般选择对照组的△Ct的均值；△△Ct：基因的△Ct值减去参考Ct（即：△△Ct =△Ct- 对照组△Ct平均值）；
（d）2^-△△Ct：即取底数为2，指数为-△△Ct即为（2^-△△Ct），在excel中输入方法（英文状态）：“=power（2, -△△Ct）”；
第二步、差异分析并做图：（统计方法的选择，不懂的同学可以收藏这张流程图），从上面我们知道是两独立样本t检验分析。所以，这里我们先安装graphPad软件：
一键安装，什么都不用管，就是永久免费使用的。安装好后有英文和中文两个版本:
随便你用。那安装好软件后我们就打开，然后输入数据：
输入数据后，我们选择非配对两独立样本t检验：
然后我们就知道有四颗星:
然后我们回到图形页面，选择个体图：
并且一键配色：
并且一键添加统计学P值:
如果你觉得1看不到，你可以调整纵坐标将其分段：
这个时候我们的图就可以复制然后粘贴到PPT中用来汇报了，一家人整整齐齐：
然后老板想看你原始数据的时候，双击即可跳转出graphpad原始数据页面：
如果这个数据可以，那我们投SCI的时候，我们就可以在graphpad页面导出emf矢量图：
再把emf拖动到ai组图中：
就可以编辑任何一个元素，组装成SCI投稿需要的图啦：
好了，这一套资源都给大家整理好了，免费获取：
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顶级CNS插图如下：
但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。
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可以随意修改颜色：
也可以随意修改大小：
Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中，并对齐：
随后画一条线，示意要D369打药：
随后添加字体，这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。
最后保存和导出，一定要记得保存，保存就是矢量图了，以后还能修改。导出就是导出为图片，用来讲PPT或者投稿。
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还有，我们下载的素材，也可以右键取消分组：
然后修改任何一个你想要修改的元素，比如修改液体的颜色：
也可以将注射器放在背上，模拟皮下注射：
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