qRT-PCR计算方法(2^-△△Ct)与GraphPad作图,用于SCI投稿:

文摘   2024-11-03 21:59   美国  

免费资源:

一、国自然类:


1 2023历年国自然标书全文

3 国自然项目答辩PPT

5 标书写作模板

7 GraphPad 9安装包

2 2018-24年国自然清单

4 基金插图素材(可编辑)

6 近10年国自然标书全文

二、SCI生信+实验类:

1 160套SCI实验操作视频

3 Meta分析范文+教程

5 泛癌分析万能代码

7 130套SCI实验视频

9 单细胞数据挖掘课

11 统计分析万能模板

2 100个SCI实验Protocol

4 miRNA预测靶基因代码

6 动物实验操作视频汇总

GEO/TCGA数据挖掘课

10 SCI写作万能模板

三、科研绘图类:

PPT科研绘图素材合集

3 Adobe illustrator绘图素材

5 动物实验矢量图素材

7 PS修各种SCI实验图视频

资源共享群

PPT科研绘图插件VIP版

4 各种实验仪器矢量图素材

6 细胞实验矢量图素材

AI科研绘图视频课

10 亲交友微信群

一、今日推送:

今天小编以qpcr为例,手把手教你GraphPad绘制符合SCI组合图要求的高清美图



1、滑动查看qPCR引物设计步骤:

qPCR现在已经成为大部分分子实验室的标配,无论是基因检测、基因定量、病原体检测、SNP分型等等实验,都涉及到qPCR技术。在整个qPCR技术中,引物设计是非常重要的一环,决定了扩增效率是否达标、扩增产物是否特异;最终决定我们的结果是否可用。


您是不是也在qPCR引物设计中不知所措:

如何使引物特异性最佳?

遇到多个转录本应该怎样设计引物?

有什么简单方法能一学就会?


在设计qPCR引物时,通常要留意以下几点:

GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……


这么多要注意的怎么办?!今天小编带大家一起设计qPCR引物,让qPCR引物设计成为你的绝杀技能。下面,我们以人的EGFR(Epidermal growth factor receptor,表皮生长受体因子)基因为例,设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物!


01

查询基因结果 

首先,通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构,这里要注意对比基因名称、种属,确保都要一致。




02

确定引物位置 

我们的目的是将不同的转录本都扩增出来,所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到,这个基因有多个不同的转录本,第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列(红框内的绿色小竖线)。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。 





03

找到mRNA的序列号 进入GenBank 

在该页面里继续往下拉,就能找到mRNA序列号,点击即可进入GenBank了。借助Highlight Sequence Features,我们可以快速确定外显子的位置。



04

确定引物位置 

点击Highlight Sequence Features后,浏览器的下方就会出现选项,选择查看exon,这样就能快速定位外显子的位置啦。我们确定了第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp。



确定位置后,点击Pick Primers,就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。



05

设计引物 

我们已经查到第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp,那在这个区间设计引物,才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意,qPCR的产物大小一般不超过300 bp,并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳,跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后,我们就可以点击Get Primers啦。



这时,NCBI就会弹出来告诉你,这样的参数选择会扩增到其他剪切变体,我们勾选不同的剪切变体并提交,就可以获得合适的引物对了! 



这些引物对的退火温度,都在60℃左右。根据实验目的,选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验,成功率还是相当高的呢!



06

引物特异性验证 

其实,Primer-Blast除了可以设计引物外,还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面,输入我们设计好的上下游引物,其它参数可以不调整,提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦,如果全部都显示在我们想要扩增的基因中,说明这对引物的特异性棒棒哒!



相当简单有木有啊~是不是感觉自己已经告别科研小白的身份,瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。


2、qPCR的2^-△△Ct计算+作图:

在临床上,比如我们收集了3个患者和3个正常人的样本(两组独立样本),然后做Wnt4基因和内参基因GAPDH的qRT-PCR定量,得到CT值。


接着我们要比较这个WNT4基因在哪个组里面表达高,哪个低。也就是目的基因减去内参基因,计算它们的2^-△△Ct,并且分析出有没有统计学意义。


那应该怎么做呢?今天我们给大家整理了无脑操作的:


“qPCR计算万能模板+GraphPad软件”

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第一步、计算2^-△△Ct:打开第一份模板,输入CT值(CT值是你自己机器上测得的哦,CT或者CP),自动得到2^-△△Ct。这个模板可以让你对照组2^-△△Ct变为1,所以你就知道实验组增加/减少了多少倍,如下:



(a)Ct:表示的是循环阈值,基因和管家基因(内参,一般是β-Actin或者GAPDH或者α-tubulin等,具体内参根据组织或者细胞而定)有其对应的Ct值;

(b)△Ct:表示的基因Ct值减去管家基因Ct值(即:△Ct =Gene△Ct- Housekeeping gene Ct);

(c)△Ct平均值(对照组):一般选择对照组的△Ct的均值;△△Ct:基因的△Ct值减去参考Ct(即:△△Ct =△Ct- 对照组△Ct平均值);

(d)2^-△△Ct:即取底数为2,指数为-△△Ct即为(2^-△△Ct),在excel中输入方法(英文状态):“=power(2, -△△Ct)”;


第二步、差异分析并做图:统计方法的选择,不懂的同学可以收藏这张流程图),从上面我们知道是两独立样本t检验分析。所以,这里我们先安装graphPad软件:



一键安装,什么都不用管,就是永久免费使用的。安装好后有英文和中文两个版本:



随便你用。那安装好软件后我们就打开,然后输入数据:



输入数据后,我们选择非配对两独立样本t检验:



然后我们就知道有四颗星:



然后我们回到图形页面,选择个体图:



并且一键配色:



并且一键添加统计学P值:



如果你觉得1看不到,你可以调整纵坐标将其分段:



这个时候我们的图就可以复制然后粘贴到PPT中用来汇报了,一家人整整齐齐:



然后老板想看你原始数据的时候,双击即可跳转出graphpad原始数据页面:



如果这个数据可以,那我们投SCI的时候,我们就可以在graphpad页面导出emf矢量图:



再把emf拖动到ai组图中:



就可以编辑任何一个元素,组装成SCI投稿需要的图啦:



好了,这一套资源都给大家整理好了,免费获取:


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此外,那现在孟德尔发文速度最快,也最简单,因为很热门。所以,今天我们要给大家免费分享:


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思路简单、数据难得。里面包括了49个组织和2700种疾病的原始数据、代码(万能代码)、实操教程。所以,你不用网络按照教程就可以傻瓜式一键得到:49个组织中任意基因的表达水平与2700种疾病的因果逻辑关系,哪个组织中哪个基因升高后会导致哪种疾病的发生


那有了这个结果,分分钟就是一篇Nature。如果不用来发生信类SCI,这个结果也可以用来佐证小鼠体内湿实验的结果。


资源部分截图如下:



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另外,发SCI,我们的数据都是通过这两大软件分析的。今天,手把手教你Graphpad+SPSS统计作图实战绘制符合SCI要求的任何图。永久免费使用的软件我们之前已经分享给大家了(点击下载SPSS点击下载GraphPad


因此,给大家免费发送的是:


“零基础Graphpad+SPSS统计作图实战课(从入门到精通)”

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资源介绍如下:



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二、资源免费送:

顶级CNS插图如下:



但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。


所以,今天小编给大家免费赠送:


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”


生物医学之家CNS插图素材部分截图如下:



这些素材都是用Adobe illustrator绘制的,打开后可以继续编辑修改,这些素材原价是9999元的,现在免费给大家送永久账户。如下免费获取永久VIP账户:


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免费发送1万个永久VIP账户,有了这个账号之后,你可以无限、永久下载生物医学之家的CNS插图素材。共有1万张素材,囊括了各种生物、人体组织、细胞、病毒、植物等。素材首页如下:



一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型,那就直接搜索鼠,有几百张小鼠插图就出现了:



有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图:



可以随意修改颜色:



也可以随意修改大小:



Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中,并对齐:



随后画一条线,示意要D369打药:



随后添加字体,这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。



最后保存和导出,一定要记得保存,保存就是矢量图了,以后还能修改。导出就是导出为图片,用来讲PPT或者投稿。



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还有,我们下载的素材,也可以右键取消分组:



然后修改任何一个你想要修改的元素,比如修改液体的颜色:



也可以将注射器放在背上,模拟皮下注射:



还可以将小鼠变为黑色:



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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞:



有了这些素材,分分钟就可以绘制如下这种高分插图:



三、各种Nature插图原图:



下载下来之后每个细微的元素都可以修改:




我们一共上传1万张Nature插图。大家赶紧获取永久VIP账户吧,投稿绘图的时候用得着:


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更多免费资源:

三、科研绘图类:

1 GraphPad绘图模板

50套R绘图万能代码

直装版PS+AI安装包

医学统计分析R版

9 单样本RNAseq分析

11 SnapGene序列比对

13 Endnnote安装包

15 R语言绘图模板

17 中文版RNAseq教程

19 Image J图片处理视频

21 更多资源在更新中.....

2 600套PPT模板

4Origin绘图模板

SPSS统计分析模板

8 铜铁死亡分析代码

10 m6A甲基化分析代码

12 qPCR计算模板

14 英文简历模板

16 R各种统计分析模板

18 46套生信分析代码

20 Sigma plot绘图软件和视频

四、生信和写作类:

1 ChIPqPCR引物设计

3 过表达引物设计

零代码复现6分SCI教程

零代码复现4分SCI教程

WGCNA分析课程

11 GO分析傻瓜式教程

13 GSEA分析傻瓜式教程

15 渐变火山图傻瓜式教程图

17 GEO+TCGA数据挖掘课

19 41GB的生信分析+实验资源

2 shRNA设计

4 Crispr-csa9素材

零代码复现5分SCI教程

8分SCI零代码复现步骤

10 超全生信数据库使用教程

12 KEGG富集分析教程

14 Meta分析范文+实操课

16 交集基因筛选高级教程

18 生信软件合集

辛苦整理,全文无任何广告!

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