蛋白翻译后修饰（PTM）通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，改变蛋白质的理化性质，影响蛋白质的空间构象、活性状态、亚细胞定位、蛋白互作等。PTM让单个蛋白质实现功能多样性，适应不同生理需求。PTM是细胞信号传递必不可少的元素，被称为细胞的“自然语言”。
蛋白质磷酸化是广泛存在的PTM之一，细胞内超过30%的蛋白质发生磷酸化修饰。磷酸化由蛋白激酶催化，将ATP或GTP的磷酸基转移到底物蛋白质的特定氨基酸位点（丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、酪氨酸Tyr）上。磷酸化是调节和控制蛋白质活性和功能的基础，有些蛋白只有在磷酸化后才能发挥作用。因此，磷酸化蛋白及其位点鉴定极为重要，有助于更好的理解相关信号通路机制。
免疫印迹WB（Western blot）是检测和定量磷酸化蛋白的常用技术。但是，在做磷酸化蛋白时，经常遇到很难爆出条带或爆不出条带的情况，甚至一个组的几个人都跑不出理想的条带。这到底是什么原因呢？
其实磷酸化蛋白WB和常规蛋白WB在操作上没有真正的差异，究其难做的原因主要在于：
蛋白磷酸化过程是可逆的。样品处理不当，会被快速去磷酸化，难以检出。
磷酸化蛋白占总蛋白的比例极低，可能不会超过10%，丰度很低难以检测。
因此，对于磷酸化蛋白WB检测，我们可以从以下几个方面进行提高。
1，确定样本中磷酸化蛋白的表达量
通过查阅文献确定某些细胞系的磷酸化蛋白表达情况，如研究癌细胞增殖相关磷酸化蛋白时，常用HeLa细胞（人宫颈癌细胞）、A549细胞（人肺癌细胞）等肿瘤细胞系。还可以通过细胞功能相关性选择表达细胞，比如研究神经信号传导相关的磷酸化蛋白，需优先选择SH-SY5Y细胞等神经元细胞。通过数据库查询表达量，如human protein atlas。
2，样本刺激时间要合理
样品中蛋白质磷酸化水平较低或不表达时，需要通过物理或化学方法进行诱导或刺激。不同靶点刺激时间和强度不同，可通过查找文献或预实验确定。刺激要充分但不宜过量，过量可能会进入负反馈，反而降低磷酸化蛋白量。
3，磷酸化蛋白提取要“快、准、冷”
磷酸化蛋白在室温下容易被磷酸酶降解，所以在制备样品时需要全程在冰上操作，提取过程要快速。建议在提取过程中使用到的器具和试剂在4℃预冷，如PBS缓冲液、研磨器等。裂解液要新鲜配制，避免反复冻融。超声处理时应保持低温，在冰上操作。裂解液中需要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
4，磷酸化蛋白检测关键点
设置阳性和阴性对照：阳性对照作为参考标准，确定磷酸化信号强度范围和变化趋势，确保验证实验有效。阴性对照确定实验结果准确性，判断条带特异性及背景信号强弱。
添加内参抗体和总蛋白抗体：内参抗体结果是实验质量控制指标，对不同样品的蛋白上样量、转膜效率等标准化，避免因实验操作误差导致结果偏差。总蛋白抗体可分析磷酸化蛋白占比变化情况，排除非磷酸化因素的影响。
建议使用BSA做封闭液，以降低非特异结合，减少背景干扰，提高信噪比。不建议使用奶粉作为封闭剂，因为奶粉中含有酪蛋白，会产生高背景信号，残留磷酸酶影响检测准确性，且奶粉批间一致性差，影响实验重复性。
其它操作细节，如使用TBST洗液、4℃过夜孵育一抗，仔细查看抗体使用说明书是保证实验成功的关键。
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