来源:丁香学术
研究背景
磷是生命体中最重要的元素之一。磷酸是生物大分子的重要结构成分,包括核酸和磷脂等,为基因组和细胞膜提供了稳定的骨架;同时磷酸化和去磷酸化也是生物界最常用的信号转导方法之一,通过磷酸化或者去磷酸化改变蛋白质的表面电荷,进而传递相关的生物化学信息;此外,磷酸还是 ATP 的重要组成部分,ATP 水解的能量驱动了生命的维持和发展。因此,细胞如何调控自身的磷酸稳态至关重要 (1)。在这其中,各种磷酸转运蛋白占据主导地位。在高等生物中,鉴定到了多个负责磷酸摄入的转运体蛋白,包括 SLC20、SLC34 家族;有趣的是,目前唯一鉴定到的将磷酸排出细胞的膜蛋白是 XPR1(2, 3)。
已有的研究表明,XPR1 主要负责将细胞内多余的磷酸排出细胞,这个功能受到焦磷酸肌醇的调控-焦磷酸肌醇的量随着细胞的磷酸浓度升高为增加,被视作为细胞的能量传感器 (4)。XPR1 功能受损,导致细胞内磷酸的过量积累,最终导致组织器官出现钙化。
目前已发现的 XPR1 的突变引起的疾病,主要集中在神经系统。以原发性家族脑钙化为例。这是一种罕见的神经系统疾病,其特征是基底节区、齿状核和丘脑的双侧发生磷酸钙的沉积。患者会表现出各种神经系统紊乱症状。XPR1 的突变导致的磷酸外排功能受损,会增加细胞内的磷酸浓度,所以 XPR1 突变介导的磷酸钙沉淀可能主要发生在细胞内,类似于骨矿化时成骨细胞的特征 (5, 6)。
近年来对 XPR1 的功能和结构研究层出不穷。上月Nature 杂志发表姜道华团队对 XPR1 的结构解析工作之后,2024 年 9 月 26 日,Science 以「First Release」的形式提前在线发表了上海精准医学研究院曹禹课题组联合中国药科大学于烨课题组的研究论文「Structural basis for inositol pyrophosphate gating of the phosphate channel XPR1(磷酸通道 XPR1 受肌醇焦磷酸门控的结构基础)」,揭示了焦磷酸肌醇如何调节 XPR1 开放并进行磷酸外排的分子机制。
研究内容
通过结构生物学与电生理的技术手段,作者团队针对人类 XPR1 的结构、功能与调控方式进行了全面的解析,发现 XPR1 具备多磷酸肌醇门控的磷酸外排通道的基本结构与电生理特征,并揭示了多磷酸肌醇以「双位点模式」的结合方式调控 XPR1 磷酸外排的分子机制(图 1)。
图 1:多磷酸肌醇以「双重结合」 的激活方式调控 XPR1 磷酸外排的分子机制
通过冷冻电镜的数据处理与分析,发现人类 XPR1 呈现同源二聚体结构。加入门控激动剂 IP6 后,XPR1 二聚体构象发生了明显改变,电镜样品中出现了开放态、关闭态和关闭-开放混合态的异二聚体,表明 IP6 能够使得 XPR1 激活,进入工作状态(图 2)。
图 2:hXPR1 的多构象结构
对比 XPR1 开放态和关闭态,可以观察到一条贯穿膜内外的通道,XPR1 的 9a 跨膜螺旋负责了控制通道的开放和关闭(图 2),这提示 XPR1 运输磷酸的行为更像是一个离子通道,而非通过传统的转运体的模式转运磷酸。
研究团队利用膜片钳的方法表征了 XPR1 的通道行为。全细胞膜片钳记录所显示的显著宏观电流,与单通道记录中磷酸根离子的快速通透及其开关转换现象,进一步确立了 XPR1 作为多磷酸肌醇门控磷酸通道的分子功能(图 3)。
图 3:XPR1 的单通道电流分析
尽管 XPR1 的多个构象得到解析,但是由于跨膜结构域与 SPX 结构域之间的高度柔性的空间排布,很难探究 SPX 结构域调控跨膜结构域的行为。最终,通过在样品中加入磷甲酸-PPF- 一种磷酸类似物和 IP6,成功获得了 XPR1 的跨膜结构域和 SPX 结构域的高分辨率的整体结构(图 4)。这一结构整体呈 C2 对称,跨膜磷酸通道处于关闭状态。两个 SPX 结构域通过「头-尾」连接的方式形成二聚化,但是两个 SPX 结构域没有直接相互作用,只能通过 IP6 介导进行二聚化(图 4 左)。另外,PPF 的电子密度则位于通道之内,堵在 XPR1 的通道中央(图 4 右)。
图 4:XPR1-PPF/IP6 的 IP6 结合簇(A 和 B)与 PPF 结合簇(C)
同时,为了捕获 XPR1 工作的中间态,研究人员通过加入钨酸根(WO42-),获得了关闭-开放构象转换中的中间态结构(图 5 左)。与开放构象比,中间态构象的冷冻电镜数据观察到了清晰的 SPX 结构域;与使用 IP6/PPF 所捕获的关闭构象相比,IP6/WO4 模型的构象不再呈现 C2 对称,SPX 二聚体发生了倾斜。
图 5:hXPR1-IP6/WO4 处于关闭-开放构象转换中的中间态
鉴于 SPX 结构域和跨膜结构域的极大的相对柔性,尝试获得清晰的 SPX 结构域非常困难。结构信息显示,SPX 结构域自身二聚化,以及 SPX 和跨膜结构域的相对稳定,可能是 XPR1 打开磷酸通道的前提条件。此外,此前的功能研究提示,焦磷酸肌醇具有远比磷酸肌醇更为强大的 XPR1 激活能力 (7)。
为了探索焦磷酸肌醇更高激活能力的分子机制,研究人员利用酶法催化结合化学分离方法,制备了较高纯度的 IP7 化合物,电生理的结果也证实,XPR1 对 IP7 的亲和力约为 IP6 的二十倍左右(图 6)。并以此获得了 XPR1-IP7 的复合物电镜结构。出乎意料的是,XPR1 中存在着另一个多磷酸肌醇结合位点。(图 6)。
图 6:hXPR1-IP7 复合物的双位点调控模式
与已知的 SPX 二聚体间的结合位点(称之为 interSPX 位点)不同,第二个焦磷酸肌醇的结合位点位于 XPR1 单体的跨膜结构域与 SPX 结构域之间组成的空腔(称为跨膜-SPX 位点)。与 interSPX 位点相似,都有极高的正电荷密度。不同的是,跨膜-SPX 位点两边的碱性氨基酸残基侧链的空间距离更远。与 IP6 分子相比,IP7 上的焦磷酸基团拥有更高更远地负电荷表面尺寸,因此可以更好地卡在跨膜-SPX 位点中,并稳定了整体 C2 对称构象,从而激活 XPR1(图 6)。
综上所述,作者团队提出 XPR1 作为多磷酸肌醇门控的磷酸通道,行使磷酸外排通道的功能。焦磷酸肌醇结合在两个 SPX 结构域之间,以及跨膜区和 SPX 结构域之间,组成 XPR1 : PP-InsPs = 2 : 4 的复合物,稳定 XPR1 的整体构象,极大地降低了通道打开的能量势垒。该论文发现了 XPR1 通道以一种「双位点调控模式」的方式受到多磷酸肌醇的激活,其中新鉴定出的第二结合位点对焦磷酸肌醇具有更高的选择性和亲和力。
展望
2024 年 8 月 21 日,中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心软物质与生物物理实验室姜道华团队在 Nature 期刊发表了题为 Human XPR1 structures reveal phosphate export mechanism 的研究论文。姜道华团队的研究与本研究在开放和封闭构象以及 IPs 结合机制方面有一致的发现。在此基础上,本研究首次对 XPR1 的电生理特性进行了细致的探索,更重要的是,本研究首次提出了偏向 PP-IPs 的第二个结合位点和中间态构象,提供了肌醇焦磷酸门控 XPR1 磷酸外排的全面视角。综上,这两项研究推动了人磷酸盐转运蛋白结构机制的理解,为开发治疗和诊断分子工具奠定了基础。
研究支持与合作
本论文由上海第九人民医院精准医学研究院与骨科曹禹研究员与中国药科大学的于烨教授所率团队联合完成,第一作者为上海第九人民医院博士生鲁毅、中国药科大学博士生岳晨茜、美国西南医学中心的张丽博士和上海仁济医院的姚德强副研究员。本项研究的完成得益于上海九院骨科赵杰教授与秦安研究员以及复旦大学周璐教授的合作与支持,并获得国家自然科学基金、上海市教委 「IV 类高峰」项目、上海市运动系统退变与再生前沿科学基地的支持。