全文刊载于《前瞻科技》2024年第3期“微米纳米技术前瞻专刊”，点击文末“阅读原文”获取全文。
-浙江大学副研究员
-中国微米纳米技术学会微纳流控分会秘书长
-浙江大学求是特聘教授，博士研究生导师
-浙江大学微分析系统研究所所长
-浙江大学杭州国际科创中心分子智造研究所所长
类器官是由干细胞发育来的体外自组织的三维细胞复合体，是比常规二维细胞更具模拟体内生理状态的理想药物筛选模型。微流控技术因其对微量流体的灵活操控能力，很好地契合了类器官高通量药物筛选的技术需求，因此微流控技术在类器官药物筛选中获得了广泛关注和研究。文章对现有基于微流控的类器官培养和药物递送技术等进行了分类综述，在此基础上对微流控类器官技术在患者来源类器官的药物敏感性测试和新药筛选方面的应用进行了介绍，并对微流控在类器官药物筛选更进一步的应用和发展方向进行讨论和展望。
类器官（Organoid）是干细胞经体外培养分化的三维结构微型细胞簇，初始干细胞群体主要来源于胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESC）、诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC）、成体干细胞（Adult Stem Cell, ASC）或者肿瘤干细胞。这些初始的干细胞群体在特定的培养基、细胞因子、化学小分子抑制剂/激活剂及其他添加剂等物质的作用下，经过自组织并分化为特定的功能性细胞群，具备了类似相应器官的组织结构和遗传学特点。2009年，Hans Clevers团队首次将Lgr5+肠道干细胞在体外成功培养成具有隐窝-绒毛三维结构的小肠类器官。类器官虽然不是真正意义上的完整器官，但是它能够再现原始生理和病理组织复杂的细胞异质性和空间结构，能长期稳定传代培养，很大程度上模拟体内器官的结构和功能。目前，类器官已经成为生物医学一个重要的研究模型，被广泛应用于器官发育、再生医学、发病机制、宿主-微生物相互作用、毒理学、药物筛选、精准医学等方面的研究。2022年12月，美国取消新药的动物实验强制要求，新的法规允许在临床前测试阶段使用诸如类器官等技术代替传统的动物实验。由此可见，类器官作为有效的药物研发技术已经获得了广泛的认同。
微流控（Microfluidics）是通过微米级通道网络对纳升至微升级流体进行操控的技术。微流控技术可在微通道网络芯片实现样品处理、分析和反应等复杂功能，已被广泛应用于化学、生物、医学和工程等领域。常规类器官培养和研究技术在病理研究、药物筛选等方面的应用面临多个方面的挑战，如有限的类器官生长微环境调控手段、受限于人工操作的通量、样本消耗量大等问题。微流控技术对微量流体的精确操控水平和高通量能力很好地满足了类器官研究在实际应用中的需求。因此，将微流控技术应用于类器官研究，能够精确控制培养环境中的物理和化学参数，如营养物质浓度、CO2水平和废物排出。微流控技术可以动态调整培养条件，通过改变流速和流向，模拟体内动态环境，如血流和组织间液流。这种动态培养条件有助于类器官更真实地反映体内的生理和病理过程，使类器官的培养更加接近自然生理状态。微流控还可以动态连续生成独立的类器官或在并行微结构单元中进行类器官培养，实现高通量的类器官培养和药物筛选，这种高通量筛选能力能够加快药物测试和疾病研究的进程，大幅度提高实验效率。此外，采用微流控培养系统，可以提高少量细胞培养获得类器官的成功率，这对于珍贵组织样品（如穿刺样品）应用的场合尤为重要，同时可减少培养基和试剂用量，降低实验成本。2023年，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）首度批准了一款基于类器官微流控芯片进行临床前研究的药物进入临床试验阶段。该事件表明，微流控类器官药物筛选作为临床前的研究手段已经达到了一个新的里程碑。
微流控类器官研究已经成为生物医学领域的重大热点，在科学研究、药物筛选和精准医疗等方面已经开始进入应用阶段。考虑应用需求的迫切性和产业化潜力，文章将对面向肿瘤个性化精准医疗的药物敏感性测试和面向新药创制的高通量药物筛选进行分类综述。这两大应用方向在实施时均包括类器官培养、药物递送、检测分析等关键环节。微流控类器官具体技术路线在实施这些方面时起着决定性作用，因此文章将从微流控的技术角度对当前的微流控类器官培养方案、药物递送方案进行分类介绍。
微流控类器官培养不同于常规孔板的形式，通常都会构建高通量的独立培养单元，这些高通量的技术以具体的实现形式可分为3类：微流控液滴、微孔和微柱。
微流控多相流液滴技术通过操纵微通道中两种及以上不互溶液体在微通道内以汇流或夹流方式来生成液滴，具有快速、超高通量的液滴生成能力，可有效减少试剂消耗、保障培养类器官的一致性。油包水液滴被包裹相可采用水相细胞悬液，同时以添加了表面活性剂的油相作为连续包裹相，通过调节两相流速，高通量地生成尺寸可控的包含了细胞的液滴，经过后续培养可在各液滴内获得类器官。该方式获得的类器官液滴周围被油包围，后续难以对水相液滴中的类器官进行有效的营养物质递送和废物的排出，因此无法进行连续长期的培养。另一种改进的形式为水凝胶类器官培养，即以水凝胶细胞溶液作为被包裹的水相，细胞预先悬浮在水凝胶溶液中，用微流控夹流的形式生成包含细胞的水凝胶液滴，水凝胶固化形成固相细胞凝胶球。该细胞凝胶球在水相中进行培养形成类器官，凝胶球外的水溶液可以不断地为细胞提供所需的营养，也可将细胞代谢废物从凝胶球内带离，因此可实现类器官的长期培养。目前，使用的凝胶材料包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、聚乙二醇等。目前，在常规类器官培养中应用最为广泛的凝胶是基质胶（Matrigel）。基质胶在低温2~8 °C时为液态，在室温时会转化为固态。因此，在低温情况下制备细胞基质胶悬液，然后通过微流控方式生成细胞基质胶液滴，再通过升温形成包含细胞的固相凝胶微球，微球生成后再转移至培养皿进行类器官的长期培养。培养获得的类器官还可通过降温使得基质胶再次液化，取出培养好的类器官进行后续的鉴定。也有研究用海藻酸盐壳加强基质胶液滴，得到水凝胶微球可在旋转生物反应器中进行类器官的培养以提高传质效率，藻酸盐壳可以保护类器官在旋转培养过程中免受剪切力和冷冻保存过程中潜在的机械损伤，促进微球内干细胞群的高效扩增。类器官最终可通过溶解外壳及基质胶进行回收。研究显示，该法培养的胃器官CD44、Lgr5和Ki67等蛋白表达高于常规孔板内基质胶培养，表明该培养方法获得的类器官具有更高的仿真性。微流控液滴特别适合生成大规模的液滴或凝胶微球，以满足后续高通量的筛选。但生成的液滴和微球通常以群体的形式存在，对于药物筛选需要再次转移到特定目标位置进行不同药物的刺激作用，因此涉及额外的转移操作，在一定程度上增加了整体筛选流程的复杂性。微流控生物打印通过将目标细胞悬浮于可生物降解的水凝胶中，水凝胶中通常还包含支架材料和生长因子等组分，整体形成生物墨水。再通过空间堆积的形式形成复合堆积体，再经培养形成类器官。一方面，生物打印可灵活控制生物材料和细胞的空间堆积方式，创建复杂肿瘤模型。另一方面，可将其以复合物平面阵列的形式打印在开放基板上，或分配到多孔板中，生成位置高度可控的类器官液滴阵列，在这些不同位置加药即可实现高通量的药物筛选。基于打印技术可在数秒内生成一个类器官，结果显示平行打印的类器官间具有高度的可重复性。此外，将多相流液滴生成与基质胶液滴的3D打印相结合，可进一步提高类器官的生成速度，10 min内可生成1 000个类器官，并以每秒1个类器官的速度将生成的类器官接种至对应孔中。得益于基质胶液滴中的高细胞密度，类器官的成熟时间得以缩短，类器官间的一致性也获得显著改善。类器官打印技术在空间堆积和定位打印方面有突出的优势，但对生物墨水的配方提出了很高的要求，为实现一些物理特性使用的异质材料对后续类器官的培养可能存在潜在的影响。微孔阵列是微流控细胞捕获、聚集和3D培养的常用形式，通过调控微结构特征可控制类器官的尺寸并获得尺寸均一的类器官，应用规模化的微孔阵列可实现高通量的类器官培养。微孔阵列可由模具法、直接铣削、3D打印等方式获得。通过制备不同形状、不同材质的微孔，可有助于均匀聚集和类器官的形成。该类系统不使用基质胶，可对微孔阵列中的类器官进行实时分析。相同数量细胞在微孔内的聚集有助于提升类器官的生成速度，并可同步群体内异质细胞的生长，提高类器官批量培养的一致性。每个微孔内生长的单类器官可方便地进行连续的动态形态监测，同时也可进行包括免疫组化、基因组、转录组等手段在内的后续分析。微孔阵列利用流体特性捕获和聚集细胞，快速高通量地培养类器官，但这些类器官难以获得连续营养供应。为此，一些研究在微孔上下层设计了培养液的灌注通道，实现了胰岛、肝脏、视网膜等多种类器官的培养和分析。IFlowPlate微流控芯片基于液压差实现了128个血管化结肠类器官的流动培养。该芯片整体类似于孔板，上方开放用于液体的操作，相邻3个孔构成1个培养单元，3个孔底部有微通道连接，中间孔用于类器官的培养，左右两孔用于培养液的储存，通过左右两孔的液位差实现培养液的灌流，培养完成的类器官还可提取用于下游分析。微柱阵列也可用于细胞的捕获聚集和空间分离，实现类器官的培养。通过微柱间的间隙进行细胞截留，被截留的细胞在阵列中进行类器官分化和发育。微柱阵列间隙便于溶液流通，因此也常被用来与灌流芯片结合，实现类器官的长期培养。该体系还可用于研究动态流体对类器官发育和功能的影响。培养液的灌流不但避免了常规的频繁换液操作，实现了营养物质的递送和废物的排出，与静态培养的类器官相比，灌流微柱平台培养的类器官展现出更好的细胞活力和更高的器官特异性基因表达。除了利用微柱阵列间隙捕获和培养类器官，另一微柱策略在于在各微柱的端面上进行类器官的培养。将含有细胞的凝胶液滴固定到各微柱的端面上，即可实现批量的类器官培养。该策略可一次性对微柱阵列上的类器官进行批量换液处理，实现微柱阵列类器官的长期培养，相较于灌流方式该法极大降低试剂的消耗。
为实现高通量的药物筛选，除了前述高通量的类器官培养技术，还需要后续高通量的药物递送和结果检测，对于微流控多相流技术产生的液滴/凝胶微球类器官培养器，可以后续通过自动化液滴和微球分配装置，将其转移到多孔板独立的孔内，进行后续药物作用和结果检测。后续流程可以融入已有的生物多孔板-移液机器人流程。因此文章不再赘述，在此主要介绍微流控高通量药物递送和快速结果检测技术。药物筛选面临的主要挑战在于实现高通量、高分析效率的同时还要保证低经济和时间成本。微流控平台的高通量、高分析效率、低试剂消耗和自动化能力，为类器官高通量药物筛选提供了有效的技术手段。通过结合微孔细胞培养和微通道药物递送，可实现自动化、高通量的类器官培养和分析。含细胞的基质胶被接种在芯片微孔上，可逆封合上具有不同流体通道的芯片层，在单次实验中同时以20种条件测试10个样品。自动化精确控制药物作用的组合、浓度、时间，大大简化了流程并减少出错的可能。此外，还可利用微流控树状分支通道实现自动产生药物浓度梯度，结合凝胶微球类器官培养技术可实现高效的肿瘤类器官化疗药物评估，原代人胰腺癌细胞在海藻酸盐凝胶微球中形成尺寸均匀的3D类器官，8级分支通道在不同凝胶类器官培养室中产生不同的药物浓度梯度，实现了不同化疗方案的动态、高通量筛选。该研究比较了3种不同患者来源的类器官药敏性，获得了与临床一致的数据。微流控药物递送技术为类器官高通量药物递送提供了强有力的支持，科研人员能够更高效地筛选和评估候选药物的效果。由于基于微流控生物打印、微孔、微柱的高通量培养的类器官均以阵列的形式培养类器官，每个类器官都有独立的培养单元，因此只要开发一个与之相匹配的药物液滴阵列，将类器官阵列与药物液滴阵列相互匹配接触，即可实现药物的高效递送。采用该策略，使用预先装载不同药液的微孔阵列，与微柱阵列上批量独立培养的类器官阵列相匹配，可进行类器官的高通量药物递送，由此实现高通量的药物筛选，也可制备与微孔阵列位置匹配的药液阵列，基于“点盖法”实现药液阵列与微孔阵列的接触，完成药物的递送。对于二维细胞药物筛选，由于细胞生长在培养皿的底部平面上，可采用明场显微成像在固定焦平面上进行细胞存活状态观察，也可以采用MTT/MTS和CCK-8等方法实现高通量的结果读取。而对于三维生长的类器官，由于其具有复杂的空间立体结构，药物作用后难以在固定的同一焦平面进行高通量成像观察，通常使用腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生物发光法测量细胞在药物作用后的凋亡情况，通过荧光酶标仪即可实现快速的信号读取。钙黄绿素（AM）/乙锭-1（ETHD-1）双染色法也常被用于检测类器官中活细胞和死细胞。AM标记活细胞，而ETHD-1标记死细胞或凋亡细胞。通过荧光显微镜或高内涵成像分析仪快速检测，可以获得细胞存活和凋亡的定量数据。ATP生物发光法难以应用于微流控定制化类器官阵列药物筛选检测，因为常规荧光酶标仪通常只能适配多孔板培养系统。而AM/ETHD-1显微成像则可适用于阵列类器官的凋亡成像检测。此外，集成各种生化传感器的微流控系统也在类器官培养和药物筛选中展现出应用潜力。通过连续监测类器官的生物标志物，可为药筛结果评估提供更多维的指标。类器官药物筛选因应用出口的不同分为两大类：其一为临床肿瘤药物的筛选，即肿瘤类器官药物敏感性测试，类器官细胞来源为患者的穿刺或手术切除样本，所培养的类器官称之为患者来源类器官（Patient-derived Organoid, PDO）；其二为新药的高通量筛选，类器官细胞来源为干细胞和肿瘤细胞系，进一步培养为各种组织和肿瘤类器官，用于新药的药效和毒理筛选。在常规的类器官培养方法中，为满足后续规模化药物筛选对样本的需求，大多需要对类器官进行培养和增殖，尤其在需要重复测试增加结果可靠性和进行多药物组合筛选的情况。类器官传代增殖会耗费大量的时间，在肿瘤类器官临床药敏实验中会推迟关键的治疗决策。同时，每次传代可能会导致细胞出现未知变异，尤其是对于原代细胞来说，这些变异可能会影响药物敏感性测试的结果。如若后续药物筛选能直接利用组织样本原代细胞完成所有计划的药物敏感性测试，那么类器官的扩增过程就不再是必需环节，由此不但可大幅缩短筛选时间，也显著降低筛选过程中的试剂消耗成本和人力成本。通过超疏水微孔阵列芯片实现了纳升尺度上的液体操控。该芯片被用于类器官的培养，细胞无须经长时间的扩增，该系统培养的肿瘤类器官通过了形态学、组织病理学、突变谱及基因表达与原始肿瘤一致性验证。该系统可在1周内完成一系列临床样本的药物敏感性测试，测试结果与临床数据充分吻合，证明了微流控类器官药物敏感性测试系统在预测患者治疗反应方面的巨大潜力。同时，微流控技术使得活检穿刺样本的类器官培养和药物敏感性测试也成为了可能。利用多相流液滴微流控技术，从活检穿刺的少量患者组织中快速生成数千个微器官球，每个液滴初始仅需数十个细胞，该系统在14 d内成功实现了肿瘤药物反应的快速预测评估。构建具有复杂微环境的PDO仍然是一个挑战，如模拟肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME），这在评估肿瘤免疫疗法中有着十分重要的意义。肿瘤免疫疗法通过患者自身的免疫系统或补充具有杀伤功能的免疫细胞进行癌细胞的杀灭，常规肿瘤类器官无法预测免疫治疗的临床反应。微流控技术通过设计多层微流控芯片，将间充质干细胞、外周血免疫单核细胞和肝癌细胞进行共培养，系统模拟构建了肝癌类器官的TME，在免疫治疗抗PD-L1药物的反应方面相比常规PDO展现出更精确的预测潜力，由此证明了微流控TME构筑在PDO预测免疫疗法疗效上的重要性。新药的开发是一个漫长且花费巨大的过程，涉及靶标验证、先导化合物发现和优化、候选药物筛选、临床前研究和临床研究，除临床试验外，这些环节基于分子、细胞及动物模型进行药物筛选。而投入巨资成功进入临床试验阶段的药物最终成药的也只有前期的10%，其主要原因是筛选所用模型与人体实际情况不一致。传统的药物筛选是通过二维细胞水平和动物水平进行，但二维细胞结构无法呈现细胞间相互作用，不能准确模拟人体结构和功能，而动物与人在基因组和蛋白组层面本身就存在差异，且动物实验价格昂贵、耗费时间长。类器官技术的出现有望解决这些问题。类器官采用人源干细胞分化培养获得，与对应的器官具有高度相似的空间组织结构，能够高仿真地重现对应器官的功能和对药物的响应。因此，以类器官代替二维细胞和动物实验进行药物筛选可获得临床一致性更高的结果，同时还具有速度快、通量高、成本低的优点。同时，类器官还可为深度测序、功能检测、表型分析提供充足的资源。基于常规细胞系的高通量药物筛选平台通常采用移液机器人配合细胞培养瓶和多孔板等方式实现。由于采用了通用的孔板形式，便于进行各环节流程的贯通和自动化。一些平台还实现了培养瓶和孔板内诱导iPSC培养和分化的所有基本步骤的自动化，包括自动处理不同的细胞培养容器，以及细胞传代、计数、活力分析、密度评估、显微成像等，可以快速且标准化地生产数十亿个iPSC，保障了干细胞来源类器官的高通量药物筛选。利用微流控液滴、微孔、微柱的高通量类器官培养方法则可以更加高效地进行单一环节的高通量培养和筛选步骤，但是完整类器官培养、药物筛选的流程还有待实现全自动化。有研究基于微流控生物打印液滴技术配合细胞非黏附表面结构，在384、1 536孔板中培养获得了均一的类器官，类器官经药物作用后用ATP生物发光法进行检测，该系统完成了3 300多种批准药物的细胞毒性试验筛选，初步证明了微流控类器官培养技术在高通量药物毒性测试中的能力。微流控类器官除了能用灌流技术实现动态培养，提高类器官的仿真性，还能利用微流控流体网络实现多类器官在同一芯片上的共培养，提供单一类器官无法实现的复杂多器官互作共培养研究模型。结合微流控微孔和灌流通道网络，可实现公共培养基的循环灌流，实现多种不同类型类器官的培养——肝脏、心脏、血管、肺、睾丸、结肠或大脑的共培养。该类创新平台类器官可长期保持高活性并表达功能性生物标志物，构建了前药被肝脏类器官代谢后产生有害代谢物的复杂体外模型，类似范例还有通过微流控微孔阵列灌流芯片构建肝、胰岛类器官相互作用系统。灌流系统实现了肝、胰岛类器官的动态培养和相互作用，通过在系统中添加降糖药二甲双胍，模拟了该药改善肝脏和胰岛病理损伤的关键过程。该类研究成功展示了微流控类器官共培养技术在体外疾病模拟和药物评估中的巨大潜力。类器官技术经过10余年的发展已日渐成熟，初步在临床药敏和新药筛选方面获得应用，国内外也均已形成一些专家共识，这些共识肯定了类器官的发展前景和应用潜力，同时也对当前发展中的一些问题和改进方案进行了总结和推荐。但常规基质胶类器官培养方案在样本初始细胞量、批量规模化培养、自动化等高通量药物筛选关键环节中仍存在问题，这些问题很大程度上限制了类器官的高效、低成本的药筛应用需求。通过微流控的微量流体操控能力，可大大降低初始样本的需求量，使得临床穿刺样品的药物敏感性实验成为可能；通过微流控液滴技术和微阵列技术，可进行规模化的类器官生成和批量并行的独立单元药物递送，实现高通量的类器官培养和药物筛选；通过微流控灌流技术可进行连续营养供给和代谢物去除，实现类器官的长期动态培养，提高类器官的仿真性。此外，结合微通道网络还可实现多类器官的共培养，构建体外复杂药物作用系统，进一步为药理毒理的深入研究提供高效模型。当然，在使用微流控类器官的过程中，仍存在一些新问题，诸如类器官药物筛选流程的整体自动化问题。常规类器官药物筛选技术以孔板加液体机器人为基础构建，兼容于生物多孔板的自动化液体操作流程，因此容易实现全流程的自动化。而当前微流控类器官研究主要还是独立地进行类器官培养、药物筛选等环节，各微流控芯片采用了不同的形式和接口，缺少整体性的考量，难以进行包括各环节的全流程自动化。后续的研究可能需要更多关注接口方面的设计，以利用当前成熟的孔板和液体机器人技术，当然也可能需要对当前液体机器人微量液体操控能力进行改进和升级，以满足微流控的要求，由此缩短微流控类器官相关技术的产业化进程。同时需要实现相关各环节的标准化，尤其在类器官培养的质控方面。当前常规的类器官培养基于显微形态学、免疫组化、荧光成像等技术进行质控，微流控类器官除了进行这些方面的质控，还可以进一步结合组学方法，在基因组、转录组、蛋白组和代谢组等方面进一步进行质控，建立分子层面的质控标准，保障体外类器官相对于体内组织的仿真性。此外，类器官的构建和药筛成本是一个不能忽视的问题，更高仿真度的类器官构建技术往往意味着更复杂的微流控系统，由此增加的成本会很大程度上降低市场的接受度。因此，以产业化为目标的微流控类器官系统需要在追求仿真度和构建成本两者之间做好平衡和选择。一个可行的思路是直接采用多孔板的整体布局，并在每个孔板单元内进行微流控设计，由此兼容已有的液体操作设备和检测设备，降低系统构建成本。上述问题的解决将进一步提高微流控类器官药物筛选的技术优势，在临床和新药创制方面获得推广和应用。类器官技术的研究和应用已经充分展现了其作为生理病理研究和药物筛选体外模型的优势。但现有类器官构建主要基于基质胶加多孔板的培养形式，实验操作仍然主要依靠人工手动进行，这种方式在一定程度上能够满足科研方面的应用需求，但是在类器官大规模产业化两个重要方向上，包括个体化医疗的临床药物筛选和新药创制的临床前实验方面，均存在构建耗时长、通量低的问题。借助微流控技术的微结构和流体通道网络可实现类器官的规模化构建和药物的高通量递送，且易于实现高仿真培养微环境的构建，已经成为类器官产业化的一个重要趋势。相信经过不断发展和进步，微流控类器官必将在临床个体化治疗和药物筛选方面发挥关键的技术优势，推动精准医疗和新药创制行业的高效、高质量发展。《前瞻科技》是由中国科学技术协会主管，科技导报社主办、出版的科技智库型自然科学综合类学术期刊，于2022年创刊。
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