Cell Death & Disease:长征医院团队发现TRIM8在肝癌中发挥致癌作用

文摘   2024-11-06 17:00   广东  

肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤,也是2020年癌症死亡的第三大原因。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌中最常见的一种类型,占所有肝癌病例的80%至90%。尽管HCC的治疗方案比以往更加多样化,患者预后也有所改善,但早期转移和频繁复发导致晚期HCC患者的五年生存率较低。因此,迫切需要研究HCC的潜在分子机制并确定新的治疗靶点。


三基序蛋白8(TRIM8)是一种E3连接酶,通过介导K63连接或K48连接的多泛素化参与底物稳定性和功能的调节。之前的研究发现TRIM8在多种肿瘤类型中发挥双重作用(致癌或抑癌),但它在HCC中的作用和潜在机制还不清楚。


上海长征医院消化内科谢渭芬教授领导的研究团队近日发现,TRIM8通过介导肝细胞核因子1α(HNF1α)泛素化并促进其蛋白降解,在HCC进展过程中发挥了致癌作用。研究表明,以TRIM8-HNF1α为靶点也许是一种很有前景的HCC治疗策略。这项研究成果于6月15日发表在Cell Death & Disease杂志上。


图片来源:《Cell Death & Disease》

(https://www.nature.com/articles/s41419-024-06819-y


研究材料与方法

在这项研究中,研究人员使用了人类HCC细胞系(包括Huh7、Hep3B和HepG2等)进行体外分析,并使用了雄性BALB/c裸鼠进行体内分析。他们采用慢病毒载体来实现TRIM8的过表达,并使用siRNA来降低TRIM8的表达。此外,研究人员还构建了TRIM8敲除的HepG2细胞系(由赛业生物提供),他们发现TRIM8基因的敲除显著抑制了HepG2细胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和质谱分析等,研究人员确认了TRIM8与HNF1α之间的相互作用及具体机制。


技术路线

01

通过分析TCGA数据发现TRIM8表达与HCC患者结局的临床相关性,并确定TRIM8对HCC恶性特征的影响

02

通过Co-IP和MS等分析发现TRIM8与HNF1α相互作用,并与HCC进展相关

03

通过CHX和Mg132处理发现TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径介导了HNF1α的降解

04

体外和体内分析表明HNF1α-K197R突变体可消除TRIM8的致癌作用


研究结果

1

TRIM8的上调与HCC患者预后较差相关

研究人员首先搜索了癌症基因组图谱(TCGA)数据集,以了解HCC组织中的TRIM8转录本水平。他们发现,与正常肝组织相比,TRIM8在HCC组织中的表达明显上调(图1)。他们还发现,TRIM8水平越高,HCC患者的无病生存期(DFS)和无复发生存期(RFS)越短。与癌旁组织相比,HCC组织中TRIM8 mRNA水平升高,蛋白表达水平也明显上调(图1)。这些数据表明,TRIM8可作为HCC的候选诊断标志物,其表达与HCC患者的结局存在临床相关性。


图1TRIM8在HCC中的高表达与HCC患者的预后不良有关[1]


为了确定TRIM8对人类HCC细胞系恶性特征的影响,研究人员利用慢病毒载体在MHCC-L细胞中增强了TRIM8的表达,并利用siRNA降低了Huh7细胞中TRIM8的表达。他们发现,过表达TRIM8能显著促进HCC细胞在体外的增殖、集落形成、迁移和侵袭。相反,抑制它则会降低HCC细胞的恶性表型。他们还发现,TRIM8基因的敲除显著抑制了HepG2细胞的增殖和克隆形成(其中TRIM8-KO细胞由赛业生物构建)。因此,TRIM8在HCC中发挥了强大的致癌作用。


为了探索TRIM8发挥作用的潜在机制,他们利用TCGA数据库开展基因组富集分析。他们发现,DNA修复、DNA复制、G2/M检查点等多条癌症相关通路在TRIM8高表达的样本中上调。KEGG分析也显示,TRIM8相关基因参与了Wnt、Hippo和PPAR信号通路以及脂质和胆固醇代谢通路。此外,RNA测序还发现,HepG2细胞中的TRIM8基因敲除会抑制几条癌症相关通路,包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。


2

TRIM8与HNF1α相互作用

为了阐明TRIM8在HCC中的分子机制,研究人员开展免疫共沉淀(Co-IP)和质谱(MS)分析来寻找TRIM8的潜在底物。MS分析表明,肝细胞核因子1α(HNF1α)与TRIM8存在潜在的相互作用。HNF1α是一种重要的转录因子,主要在肝脏中表达,在肝细胞分化、代谢调控和肝功能维持中发挥作用。之前的研究发现,HNF1α的表达下降是HCC发生和发展的关键事件。


Co-IP实验证实了TRIM8与HNF1α的相互作用,邻位连接分析(PLA)进一步确定了TRIM8和HNF1α在Huh7细胞中的位置相邻(图2)。TCGA数据表明,TRIM8的表达与HNF1α靶基因的水平呈负相关。荧光素酶报告分析表明,TRIM8能显著抑制Huh7细胞中HNF1α的转录活性(图2)。通过IPA分析,他们还发现HNF1α过表达细胞和TRIM8敲除细胞中上调的DEG主要与细胞周期、检查点调控等通路有关,也参与了癌症和肝脏疾病的调节。这些结果表明,TRIM8与HNF1α相互作用,这种互作可能在HCC的发展过程中起了关键作用。



图2 TRIM8与HNF1α相互作用并抑制HNF1α的转录活性[1]


3

TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径促进HNF1α降解

通过TRIM8的过表达和敲降分析,研究人员发现TRIM8降低了HNF1α蛋白的表达。考虑到TRIM8是一种E3连接酶,他们认为TRIM8促进了HNF1α的降解。在使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理Huh7细胞时,TRIM8能显著缩短HNF1α的半衰期,而在过表达TRIM8后,HNF1α的降解速度明显加快。同时,在蛋白酶体抑制剂Mg132处理后,HNF1α蛋白的水平显著回升。他们还观察到,TRIM8促进了HNF1α的K48连接泛素化。由此可以看出,TRIM8通过泛素-蛋白酶体途径介导了HNF1α的降解。


为了确定TRIM8介导的HNF1α泛素化位点,研究人员在Huh7细胞中过表达TRIM8,之后分离出泛素化蛋白。他们发现HNF1α的第197位赖氨酸残基被明显泛素化。在构建赖氨酸-精氨酸的突变体后,他们发现K197R突变延迟了环己酰亚胺处理后的HNF1α降解(图3)。进一步分析显示,K197R突变显著降低了HNF1α的泛素化,并抑制了TRIM8介导的HNF1α泛素化。这些数据表明,TRIM8在Lys197位点介导了HNF1α的泛素化。


图3 TRIM8促进了HNF1α的泛素化[1]


4

阻断TIRM8介导的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用

最后,研究人员试图分析阻断TRIM8对HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他们用表达HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒载体感染过表达TRIM8的细胞,发现K197R突变体削弱了TRIM8对增殖、迁移和侵袭的促进作用。之后在裸鼠身上开展的体内分析表明,TRIM8的过表达促进了肿瘤的生长,而HNF1α-K197R逆转了TRIM8对小鼠肿瘤生长的促进作用。这些结果揭示了TRIM8通过介导HNF1α的降解在HCC中发挥致癌作用。


研究结论

总的来说,这项研究揭示了TRIM8通过对HNF1α的K48连接泛素化促进HCC恶性进展的新机制。它表明TRIM8-HNF1α轴既是预测HCC预后的潜在指标,也是有潜力的治疗靶点。研究人员认为,针对TRIM8介导HNF1α降解来设计方法,有望提高HCC患者的生存率。


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参考文献:

[1]Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y


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