震惊!大量Nature论文qPCR引物不特异?

文摘   2024-12-10 22:25   美国  

免费资源:

一、国自然类:


1 2023历年国自然标书全文

3 国自然项目答辩PPT

5 标书写作模板

7 GraphPad 9安装包

2 2018-24年国自然清单

4 基金插图素材(可编辑)

6 近10年国自然标书全文

二、SCI生信+实验类:

1 160套SCI实验操作视频

3 Meta分析范文+教程

5 泛癌分析万能代码

7 130套SCI实验视频

9 单细胞数据挖掘课

11 统计分析万能模板

2 100个SCI实验Protocol

4 miRNA预测靶基因代码

6 动物实验操作视频汇总

GEO/TCGA数据挖掘课

10 SCI写作万能模板

三、科研绘图类:

PPT科研绘图素材合集

3 Adobe illustrator绘图素材

5 动物实验矢量图素材

7 PS修各种SCI实验图视频

资源共享群

PPT科研绘图插件VIP版

4 各种实验仪器矢量图素材

6 细胞实验矢量图素材

AI科研绘图视频课

10 亲交友微信群


一、今日推送:

小编最近看文献的时候发现两篇Nature的paper里面的ACTB基因的qPCR引物不特异?发出来跟大家一起分享,欢迎大家转发讨论。第一篇:


我们将引物序列通过NCBI的blast看看特异性:


结果,除了能定量到ACTB外,还有好多非特异的:


第二篇:


照样通过NCBI的blast:


也有很多非特异的:


对此,大家怎么看?正确的qPCR引物设计原理及步骤如下

免费获取下面资源:


“qPCR计算万能模板+GraphPad软件”

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你可以完成qPCR引物设计+Blast+2^-△△Ct计算+GraphPad柱形图绘制,绘制符合SCI组合图要求的高清美图



一、qPCR引物设计+引物特异性检验


qPCR现在已经成为大部分分子实验室的标配,无论是基因检测、基因定量、病原体检测、SNP分型等等实验,都涉及到qPCR技术。在整个qPCR技术中,引物设计是非常重要的一环,决定了扩增效率是否达标、扩增产物是否特异;最终决定我们的结果是否可用。


您是不是也在qPCR引物设计中不知所措:

如何使引物特异性最佳?

遇到多个转录本应该怎样设计引物?

有什么简单方法能一学就会?


在设计qPCR引物时,通常要留意以下几点:GC含量50%-60%、Tm值50℃-65℃且上下游引物尽量接近、引物末端最好是G或C、引物尽量在目的基因的3’ 端、引物尽量跨越内含子、目的基因是否有不同的剪切变体……


这么多要注意的怎么办?!今天小编带大家一起设计qPCR引物,让qPCR引物设计成为你的绝杀技能。下面,我们以人的EGFR(Epidermal growth factor receptor,表皮生长受体因子)基因为例,设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物!


01

查询基因结果 

首先,通过NCBI查询Homo EGFR的基因结构,这里要注意对比基因名称、种属,确保都要一致。



02

确定引物位置 

我们的目的是将不同的转录本都扩增出来,所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到,这个基因有多个不同的转录本,第一个转录本的第8、9个外显子区域是所有转录本的同源序列(红框内的绿色小竖线)。只需要将引物设在第8、9个外显子之间就可以了。 



03

找到mRNA的序列号 进入GenBank 

在该页面里继续往下拉,就能找到mRNA序列号,点击即可进入GenBank了。借助Highlight Sequence Features,我们可以快速确定外显子的位置。



04

确定引物位置 

点击Highlight Sequence Features后,浏览器的下方就会出现选项,选择查看exon,这样就能快速定位外显子的位置啦。我们确定了第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp。



确定位置后,点击Pick Primers,就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。



05

设计引物 

我们已经查到第8、9个外显子的位置是1151-1394 bp,那在这个区间设计引物,才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意,qPCR的产物大小一般不超过300 bp,并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳,跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后,我们就可以点击Get Primers啦。



这时,NCBI就会弹出来告诉你,这样的参数选择会扩增到其他剪切变体,我们勾选不同的剪切变体并提交,就可以获得合适的引物对了! 



这些引物对的退火温度,都在60℃左右。根据实验目的,选择长度适中、特异性好和引物自身互补较少的引物进行实验,成功率还是相当高的呢!



06

引物特异性验证 

其实,Primer-Blast除了可以设计引物外,还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面,输入我们设计好的上下游引物,其它参数可以不调整,提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在啦,如果全部都显示在我们想要扩增的基因中,说明这对引物的特异性棒棒哒!



相当简单有木有啊~是不是感觉自己已经告别科研小白的身份,瞬间掌握了qPCR引物设计的绝招啦。


二、qPCR的2^-△△Ct计算+作图:


在临床上,比如我们收集了3个患者和3个正常人的样本(两组独立样本),然后做Wnt4基因和内参基因GAPDH的qRT-PCR定量,得到CT值。


接着我们要比较这个WNT4基因在哪个组里面表达高,哪个低。也就是目的基因减去内参基因,计算它们的2^-△△Ct,并且分析出有没有统计学意义。


第一步、计算2^-△△Ct:打开第一份模板,输入CT值(CT值是你自己机器上测得的哦,CT或者CP),自动得到2^-△△Ct。这个模板可以让你对照组2^-△△Ct变为1,所以你就知道实验组增加/减少了多少倍,如下:



(a)Ct:表示的是循环阈值,基因和管家基因(内参,一般是β-Actin或者GAPDH或者α-tubulin等,具体内参根据组织或者细胞而定)有其对应的Ct值;

(b)△Ct:表示的基因Ct值减去管家基因Ct值(即:△Ct =Gene△Ct- Housekeeping gene Ct);

(c)△Ct平均值(对照组):一般选择对照组的△Ct的均值;△△Ct:基因的△Ct值减去参考Ct(即:△△Ct =△Ct- 对照组△Ct平均值);

(d)2^-△△Ct:即取底数为2,指数为-△△Ct即为(2^-△△Ct),在excel中输入方法(英文状态):“=power(2, -△△Ct)”;


第二步、差异分析并做图:统计方法的选择,不懂的同学可以收藏这张流程图),从上面我们知道是两独立样本t检验分析。所以,这里我们先安装graphPad软件:



一键安装,什么都不用管,就是永久免费使用的。安装好后有英文和中文两个版本:



随便你用。那安装好软件后我们就打开,然后输入数据:



输入数据后,我们选择非配对两独立样本t检验:



然后我们就知道有四颗星:



然后我们回到图形页面,选择个体图:



并且一键配色:



并且一键添加统计学P值:



如果你觉得1看不到,你可以调整纵坐标将其分段:



这个时候我们的图就可以复制然后粘贴到PPT中用来汇报了,一家人整整齐齐:



然后老板想看你原始数据的时候,双击即可跳转出graphpad原始数据页面:



如果这个数据可以,那我们投SCI的时候,我们就可以在graphpad页面导出emf矢量图:



再把emf拖动到ai组图中:



就可以编辑任何一个元素,组装成SCI投稿需要的图啦:



好了,这一套资源都给大家整理好了,免费获取:


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此外,我们把今年培训的国自然内部资料一次性免费发送给大家(新手完全可以按照别人中过的标书模仿着写,老手也可以参考别人标书中的套路是怎么回事):


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这些标书都是全网首发,第一次发送出来,需要的赶紧收藏起来吧。资源如下



一、2018-2024国自然中标项目清单:



比如生科院和医学院的:



如医学部有1万左右:



二、国自然中标项目标书全文:


这都是已经中标的标书全文,对我们参考非常有用,部分截图如下:


(模糊截图,高清请下载)


三、几十套杰青、优青申报PPT(可编辑)


对于申报杰青、优青、长江的科研人员,一份已中的PPT模板可以很好的参考,思路逻辑格式等等:



比如优青答辩PPT:



再比如杰青的答辩:



好了,这些资料我们都已经打包好了放在百度云了,大家赶紧保存到自己的百度云中吧,非常有用。



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二、资源免费送:

很多粉丝留言有没有分析数据发SCI的实操教程。今天给大家免费分享:


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这些都是分析数据就能发SCI,比如NHANES临床数据库,它几乎适合大部分的临床科室,如:各大内科、口腔科、眼科、检验科、儿科、妇科、生殖科等,但不包括肿瘤外科以及各大需要开刀动手术的科室,也不包括核磁共振以及超声检查,中医目前也不适合。检索一下已经发表的看看,看能不能不做实验只挖掘数据发SCI:

第一步,打开 PubMed 数据库,网址:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/第二步,输入检索式:(NHANES[Title/Abstract]) AND (N[Title/Abstract])此处的 N = 你所在科室的各种常见疾病,比如神内就搜个「阿兹海默」吧,英文是「alzheimer」,那么检索式就是:(NHANES[Title/Abstract]) AND (alzheimer[Title/Abstract])



发的还是比较少的,套路也很简单,先选取患者(如成年T2DM患者),随后选取指标进行分析(如分别通过肝刚度测量的中值(LSM)和控制衰减参数(CAP)来评估肝纤维化和脂肪变;采用Logistic回归分析来评估他汀治疗与脂肪变和晚期(≥F3)肝纤维化之间的相关性)。最后结果就是评价有没有相关性。这样就是一篇2区的文章。


所以,大家赶快免费领取这7套课:


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这7套实操课,都是非常完整的课程,入门到精通,就非常好。按照实操教程,分分钟就能发表SCI。涵盖了孟德尔随机化分析,联合免疫、代谢、肠道菌群,还有PheWAS分析、NHANES分析等。



一共130GB,赶紧保存到自己的百度云,按照操作教程先发一篇SCI再慢慢学吧。毕竟发了SCI才是硬道理。


部分截图如下(课程+课件+代码都是齐全的哦,只是这里篇幅有限,我就部分截图了):



这些我都已经上传百度云了,大家赶紧免费保存吧:


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三、免费资源:

顶级CNS插图如下:



但是自己画一只小鼠可能需要花一整天的时间。


所以,今天小编给大家免费赠送:


“生物医学之家CNS插图可编辑素材永久VIP账户”


生物医学之家CNS插图素材部分截图如下:



这些素材都是用Adobe illustrator绘制的,打开后可以继续编辑修改,这些素材原价是9999元的,现在免费给大家送永久账户。如下免费获取永久VIP账户:


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免费发送1万个永久VIP账户,有了这个账号之后,你可以无限、永久下载生物医学之家的CNS插图素材。共有1万张素材,囊括了各种生物、人体组织、细胞、病毒、植物等。素材首页如下:



一、比如我需要用到小鼠插图来描述自己的小鼠动物实验模型,那就直接搜索鼠,有几百张小鼠插图就出现了:



有了VIP账号之后就可以随意下载。下载下来是AI绘制的可编辑图:



可以随意修改颜色:



也可以随意修改大小:



Ctrl+c和V复制粘贴到自己的画板中,并对齐:



随后画一条线,示意要D369打药:



随后添加字体,这样审稿人一看就知道你做了什么动物模型。



最后保存和导出,一定要记得保存,保存就是矢量图了,以后还能修改。导出就是导出为图片,用来讲PPT或者投稿。



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还有,我们下载的素材,也可以右键取消分组:



然后修改任何一个你想要修改的元素,比如修改液体的颜色:



也可以将注射器放在背上,模拟皮下注射:



还可以将小鼠变为黑色:



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二、比如我需要绘制细胞机制图。那就搜索细胞:



有了这些素材,分分钟就可以绘制如下这种高分插图:



三、各种Nature插图原图:



下载下来之后每个细微的元素都可以修改:




我们一共上传1万张Nature插图。大家赶紧获取永久VIP账户吧,投稿绘图的时候用得着:


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更多免费资源:

三、科研绘图类:

1 GraphPad绘图模板

50套R绘图万能代码

直装版PS+AI安装包

医学统计分析R版

9 单样本RNAseq分析

11 SnapGene序列比对

13 Endnnote安装包

15 R语言绘图模板

17 中文版RNAseq教程

19 Image J图片处理视频

21 更多资源在更新中.....

2 600套PPT模板

4Origin绘图模板

SPSS统计分析模板

8 铜铁死亡分析代码

10 m6A甲基化分析代码

12 qPCR计算模板

14 英文简历模板

16 R各种统计分析模板

18 46套生信分析代码

20 Sigma plot绘图软件和视频

四、生信和写作类:

1 ChIPqPCR引物设计

3 过表达引物设计

零代码复现6分SCI教程

零代码复现4分SCI教程

WGCNA分析课程

11 GO分析傻瓜式教程

13 GSEA分析傻瓜式教程

15 渐变火山图傻瓜式教程图

17 GEO+TCGA数据挖掘课

19 41GB的生信分析+实验资源

2 shRNA设计

4 Crispr-csa9素材

零代码复现5分SCI教程

8分SCI零代码复现步骤

10 超全生信数据库使用教程

12 KEGG富集分析教程

14 Meta分析范文+实操课

16 交集基因筛选高级教程

18 生信软件合集

辛苦整理,全文无任何广告!

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