近年肿瘤血管生成领域的研究不断深入，成为国家自然科学基金的热点话题。今天，我们将以一个 2023 年成功获批的肿瘤血管生成研究项目为例，为大家详细解析国自然申请书的撰写技巧。中标项目：LGALS1/CD276/STAT3 促进肿瘤血管生成介导膀胱癌进展的机制和功能研究LGALS1：LGALS1 是一种蛋白，全称为半乳糖结合凝集素 1（Galectin-1）。它是一种 β-半乳糖结合的凝集素，能够通过与多种细胞表面的糖结合，参与调控细胞的增殖、凋亡、黏附和细胞间信号传递等过程。在肿瘤中，LGALS1 通常被过表达，并与肿瘤的免疫逃逸、肿瘤细胞的侵袭和转移以及肿瘤血管生成等多个方面有关，它可以促进肿瘤的进展。CD276：CD276（B7-H3）是 B7 家族成员之一，是一种免疫检查点分子，通常在多种类型的肿瘤细胞表面表达。它的表达与肿瘤的免疫逃避、增殖和转移密切相关。CD276 通过与免疫系统中的受体相互作用，可以促进肿瘤细胞逃避免疫监视，进而促进肿瘤的生长和转移。STAT3：信号转导和转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3），是 STAT 蛋白家族的成员之一，参与细胞生长、分化、凋亡和免疫调节等多个重要生物过程。在多种肿瘤中，STAT3 的持续激活与肿瘤的发生、发展密切相关，它可以促进细胞的无限增殖、抑制凋亡、促进血管生成和炎症反应，从而有利于肿瘤的生长和转移。肿瘤血管生成：是指肿瘤内部新血管的形成过程，这是肿瘤生长和转移的一个关键环节。肿瘤通过分泌血管生成因子（如 VEGF）等分子，促进周围正常血管向肿瘤组织内生长，为肿瘤提供养分和氧气，同时也为肿瘤细胞的扩散提供了通道。在本项目中，LGALS1、CD276、STAT3 这三个分子可能形成一个或多个信号传递路径，促进肿瘤血管生成和膀胱癌的进展。这些信号轴的具体调控机制可能涉及上述分子相互之间的直接或间接相互作用，以及它们与其他信号分子的相互作用，共同影响肿瘤的微环境，促进肿瘤血管的形成和肿瘤细胞的增殖、生存和迁移。本项目的思路大致为：LGALS1、CD276 和 STAT3 通过相互作用和信号传递，促进肿瘤血管生成，导致膀胱癌的进展。（4）提出假设（根据研究热点和预实验数据，提出自己的科学假说，一句话）；（5）拟进行研究（研究内容的缩写，打算怎么证明或验证假设）；（6）研究意义。同时撰写时严格把控字符数（400）膀胱癌是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，由于其高复发率和死亡率，迫切需要新型治疗策略。目前，关于 LGALS1/CD276/STAT3 轴在膀胱癌血管生成中的作用及其机制研究仍然有限。我们的前期研究发现，LGALS1、CD276 和 STAT3 在膀胱癌组织中高表达，并且与患者的预后密切相关。进一步的实验表明，这三种分子能够促进膀胱癌细胞的血管生成。因此，我们提出科学假说：LGALS1/CD276/STAT3 轴通过促进肿瘤血管生成导致膀胱癌进展。为验证这一假设，我们计划在组织样本水平、体内、体外和分子水平，利用免疫组化、小鼠异种移植模型、细胞培养和基因敲除等技术，明确 LGALS1/CD276/STAT3 轴的功能作用，阐释其促进膀胱癌血管生成的作用机制，评价其在膀胱癌治疗中的应用潜力。此研究有望揭示 LGALS1/CD276/STAT3 轴在膀胱癌进展中的关键作用，为开发新型膀胱癌治疗策略提供理论依据。1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；
立项依据的撰写主要包括几个部分：
- 目前的国内外研究有哪些缺陷，哪些问题，从何处入手？
- 我们在前期工作中发现了什么，即预实验，为什么我来研究这个问题最合适以及为何产生此假说？即阐明假说形成的思路过程。
- 凝练出本课题的关键科学问题，提出「研究假说」。简要说明你的研究思路。
国自然基金重在科学假说的创新性、合理性、明确性、逻辑性、科学性、完善性，缺一不可。但是点到为止，既要证明该假说的合理，又不能把所有的实验都做完，是一个拼图游戏，所以这里面分子机制的实验数据列举需要有个度，预实验达到总研究内容的 30% 左右为宜。1. 选择权威和有影响力的文献；2. 引用最新的研究成果：近 3 年，不可引用太老的文章，且需引用几篇申请当年发表的文献；3 引用适量的文献：在立项依据中，不要过度引用文献，也不要过于依赖文献堆砌，青年、地区 30 篇左右，面上 40 篇左右即可。1.1 研究意义：揭示新型治疗靶点对抗膀胱癌进展的重要性这一部分应当介绍为什么研究膀胱癌的新型治疗靶点是重要的。可以讨论膀胱癌的流行病学数据，目前的治疗方法以及它们的局限性，从而强调开发新治疗方法的迫切需要和潜在影响。1.2 LGALS1/CD276/STAT3 轴的高表达与膀胱癌患者预后负相关在这部分，应详细介绍 LGALS1、CD276 和 STAT3 三个基因/蛋白在膀胱癌中的表达情况以及它们如何与患者的预后相关联。可以通过回顾相关文献和研究，展示这一轴线如何影响膀胱癌患者的生存率和疾病进展。1.3 LGALS1/CD276/STAT3 轴促进膀胱癌细胞血管生成这部分应聚焦于如何 LGALS1/CD276/STAT3 轴通过促进血管生成来影响膀胱癌的发展。可以探讨这一信号通路的生物学机制，以及它如何促进肿瘤微环境中的血管形成，进而支持肿瘤生长和扩散。这一节应详细阐述肿瘤血管生成（即血管新生）对于膀胱癌进展的作用。介绍血管新生的生物学基础，如何为肿瘤提供必需的养分和氧气，以及这如何与膀胱癌的侵袭性和转移能力相关联。最后一部分应提出本研究的科学假说，并详细描述后续的研究计划。包括预计采用的实验设计、预期结果及其对膀胱癌治疗可能产生的影响。此外，还应该讨论假设验证的方法，如果假设成立，可能对治疗膀胱癌的策略带来哪些新的见解。①目标清晰，层次分明，只写目标，不用再重复研究意义、用什么方法研究，且目标具体，可实现。可按照明确 …… 关系；揭示 …… 规律；理解 …… 作用；阐明 …… 机制等的模板撰写1. 明确 LGALS1/CD276/STAT3 信号轴在膀胱癌中的表达关系及其与疾病严重程度之间的相关性。2. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 轴促进肿瘤血管生成的分子机制和信号通路。3. 理解 LGALS1/CD276/STAT3 信号轴在膀胱癌进展中的整体作用及其作为治疗靶点的潜力。研究内容的撰写需注意是为了达成研究目标而要去做的研究，与研究目标呼应，为具体研究方案的框架，撰写过程中可按照临床样本、动物水平、细胞水平分层次撰写，阐明做什么事达成什么目的。同时明确细胞、动物模型的选择和构建。那么，该如何撰写呢？我们这里以图文的形式为大家展现（注意，这里的配图仅是为了大家直观地理解研究内容的写作，并非是技术路线图，实际的标书中研究内容部分并不需要该图）在本研究的临床部分，将收集 100 例膀胱癌患者的新鲜肿瘤组织样本及相应非肿瘤对照组织。通过免疫组化（IHC）和免疫荧光技术，检测 LGALS1、CD276 和 STAT3 蛋白的表达，评估它们在膀胱癌组织中的定位和表达水平。此外，将使用流式细胞术分析肿瘤微环境中免疫细胞的组成，尤其是 T 细胞和巨噬细胞的亚群，探究免疫微环境与肿瘤进展的关系。通过定量 PCR 和 Western blot 进一步验证 LGALS1、CD276 和 STAT3 的 mRNA 和蛋白水平，以及它们在肿瘤进展中的表达动态。使用 NOD-SCID 小鼠，通过尾静脉注射 T24 或 5637 膀胱癌细胞株构建膀胱癌模型。动物分为四组：对照组、敲除 LGALS1 组、敲除 CD276 组以及 STAT3 敲除组。应用 CRISPR/Cas9 技术进行基因编辑。将通过免疫组化分析血管内皮细胞标志物 CD31 和平滑肌肌动蛋白 α-SMA 来定量血管生成和肿瘤间质变化，使用超声成像技术评估肿瘤大小及血流情况，为评估肿瘤血管生成提供直观的生理信息。通过 EdU 增殖检测评估细胞增殖活性。通过 TUNEL 检测评估细胞凋亡。通过 HE 染色评估组织形态，通过染色组织切片观察肿瘤的细胞结构和组织构造。计算肿瘤体积，通过定期测量肿瘤的三维尺寸估算其体积，以评估肿瘤生长的速度和模式。选择 T24、5637 和 UM-UC-3 膀胱癌细胞系进行细胞实验，分为：对照组、LGALS1 敲除组、CD276 敲除组、STAT3 敲除组以及挽救实验组：LGALS1 敲除后 CD276 过表达组及 CD276 敲除后 STAT3 过表达组。利用 CRISPR/Cas9 技术敲除基因，并通过慢病毒转染技术恢复基因表达。细胞功能实验包括 CCK-8 细胞增殖实验、流式细胞术检测细胞凋亡，以及实时细胞分析仪（RTCA）评估细胞迁移和侵袭能力。此外，通过 Matrigel 基质胶进行管型形成实验，结合 VEGF 和 bFGF 的 ELISA 分析，全面评估细胞的血管生成能力。利用 RNA 干扰技术（RNAi）、CRISPR/Cas9 基因编辑技术精确调控 LGALS1、CD276 和 STAT3 的表达，并结合定点突变技术探讨这些因子在膀胱癌中的作用。特别关注它们如何通过促进血管生成和肿瘤细胞的增殖来影响膀胱癌的进展。使用质谱分析检测蛋白质的修饰和相互作用，理解信号传导途径的动态变化和调控机制。ChIP-seq 分析研究蛋白-DNA 相互作用，尤其是转录因子如 STAT3 在基因表达调控中的作用。单细胞 RNA 测序分析细胞异质性和基因表达，提供对肿瘤细胞群体内部复杂性的深入视角。通过大数据分析识别关键的信号调控网络，评估它们在肿瘤进展中的作用。关键科学问题的撰写需要凝练出本项目的重点难点问题，同时与研究目标、研究内容相呼应，使得研究目标就是去解决这个问题，而研究内容就是解决这个问题的方式。撰写中在提出科学问题之后还要解释一下为什么这是关键科学问题；并给出解决方案，如何去解决这个问题。在青年、地区项目中，关键科学问题通常写 2 个即可，面上则撰写 3 个为宜。1. 明确 LGALS1/CD276/STAT3 轴在促进肿瘤血管生成中的具体功能是本项目拟解决的关键科学问题之一。这一问题的关键性在于，尽管已知该信号轴与膀胱癌进展相关，但其在肿瘤血管生成中的确切作用及作用机制尚未清晰。本项目拟通过细胞功能实验（如管型形成、迁移和侵袭实验）、动物模型（如裸鼠异种移植模型）和免疫组织化学分析，证实 LGALS1/CD276/STAT3 轴对肿瘤血管生成的促进作用。2. 阐明 LGALS1/CD276/STAT3 轴促进肿瘤血管生成的分子机制是本项目拟解决的关键科学问题之二。解析这一机制对于揭示膀胱癌发展的新机理和发现新的治疗靶点至关重要。本项目拟通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）、Western blot 分析和双荧光素酶报告基因实验，探索 LGALS1/CD276/STAT3 轴在细胞内的信号传递路径和关键下游效应分子。3. 揭示 LGALS1/CD276/STAT3 轴作为膀胱癌治疗新靶点的潜力是本项目拟解决的关键科学问题之三。鉴于膀胱癌治疗的迫切需求，发现新的治疗靶点具有重要的临床意义。本项目拟通过药物敏感性测试（细胞存活率实验）、基因敲除或过表达后的动物模型研究，以及免疫组织化学评估治疗后肿瘤组织的血管密度变化，评估靶向 LGALS1/CD276/STAT3 轴的治疗干预对肿瘤血管生成和膀胱癌进展的影响，证实其作为治疗靶点的应用潜力。2024 年度国自然医学部 50 大科研热点中标数统计如下：如果大家想进一步与同行、国自然资深讲师交流，并获取一手动态和热点方向，可以加入「国自然基金撰写交流社群」哦。群内也会定期为大家分享优质课程、撰写经验、模板资料等。
