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转录效应物是已知的可以激活或抑制基因表达的蛋白质结构域；然而，对于哪些效应物结构域在基因组、细胞类型和 DNA 结合结构域（DBD）环境中调节转录缺乏系统的了解。2024年11月1日，国际著名期刊《Nature Biotechnology》在线发表了题为“Development of compact transcriptional effectors using high - throughput measurements in diverse contexts”的研究论文。作者开发了 dCas9 介导的高通量招募（HT - recruit）方法，可以量化内源靶基因上效应物的功能，并测试了不同环境下效应子的功能，发现许多效应子依赖于靶点和 DNA 结合结构域（DBD）环境。进一步为了实现有效的转录抑制，作者选择了稳定的结构域，包括 ZNF705 KRAB，它改进了 CRISPRi 工具以沉默启动子和增强子。通过组合 NCOA3、FOXO3 和 ZNF473 结构域构建了一种紧凑的人源激活子NFZ，能够实现高效的CRISPRa。![]()
超过 10% 的人类基因编码的蛋白质定位于细胞核并在 mRNA 转录水平上调节基因表达。这些转录因子（TFs）和染色质调节蛋白是用于合成生物学和剖析生物过程的潜在有用效应物结构域的宝库。转录效应物结构域，也称为激活子和抑制子，被招募到基因启动子上时能够增加或沉默基因的转录。然而，转录效应物根据其被招募到基因的生物学环境不同而具有不同的功能。目前的筛选方法虽扩展了效应子序列，但未比较多种生物环境下的活性，且多数效应子的其他特性尚未明确。作者进行高通量招募（HT-recruit）来测量人类核蛋白中5092个Pfam注释结构域（Pfam文库）在17种生物学背景下的效应功能，并将这些数据与两个已有的数据集进行整合，以及构建了覆盖所有人类染色质调节因子和转录因子的更大文库（CRTF平铺文库）。将文库中的结构域与 rTetR 或 dCas9 融合，以低感染复数（MOI）转染细胞系，使大多数细胞表达单个 DBD - 结构域融合蛋白。首先，为了在保持其他参数不变的情况下研究不同的启动子生物学环境，作者开发了一组具有不同启动子来源和强度的报告基因系统（图1a）。在 K562 和 HEK293T 细胞的 AAVS1 安全港位点安装具有不同启动子的报告基因，包括 minCMV、NTX、NT21、pEF1α、UbC、PGK 和 RSV 等。根据启动子的表达特性和对效应子的响应，选择合适的报告基因用于后续实验。研究结果发现，效应子功能存在环境的特异性。1. 启动子特异性：不同启动子对效应子的响应存在差异，如在 K562 细胞中，一些启动子可被激活，而另一些则被抑制。在不同细胞类型中，相同启动子对效应子的响应也不同，如 PGK 启动子在 K562 细胞中是组成型激活的，但在 HEK293T 细胞中是背景沉默的。2. 细胞类型特异性：一些效应子在不同细胞类型中的功能存在显著差异，如 WW、SRC Homology 3（SH3）、plant homeodomain（PHD）和 SMARCA2/SMARCA4 QLQ 结构域在 K562 细胞中的激活作用更强，而在 HEK293T 细胞中则较弱。3. DBD 特异性：DBD 也会影响效应子的功能，如在某些情况下，dCas9 比 rTetR 更能有效地招募效应子到靶基因上。![]()
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图1 HT-recruit 量化跨 DBD、细胞类型和靶基因环境的转录效应子功能
进一步，作者发现了部分效应子家族的功能特点。作者发现在 HLH 家族中HLH 结构域可以作为激活子或抑制子，其功能依赖于所处的具体环境。在一些情况下，HLH 结构域可以激活 CD2 基因，但同时也可以抑制 pEF1α 基因。进一步在KRAB 家族中发现KRAB结构域是一种强效的抑制子，在不同情境下表现出较高的稳定性和可重复性。通过筛选，发现了一些比传统使用的 ZNF10 KRAB 更强效的 KRAB 结构域，如 ZNF705 KRAB 和 ZNF471 KRAB。并进一步在不同的细胞类型和靶点上验证了 ZNF705 KRAB 和 ZNF471 KRAB 的抑制功能，发现它们可以有效地沉默基因表达，且具有较低的毒性。![]()
图2 环境依赖性转录效应器
作者选择了在多个激活筛选中排名靠前的 NCOA3、FOXO3 和 ZNF473 结构域，构建了紧凑的人源激活子 NFZ。通过比较发现NFZ 在巨噬细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）和 T 细胞中表现出高效的激活功能，且比传统的激活子 VPR 和 SAM 更易于通过慢病毒递送，并且在诱导型通路中具有更低的脱靶激活。![]()
图3 紧凑型NFZ激活剂改善不同细胞类型的CRISPRa系统
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图4 紧凑的NFZ激活系统改善了治疗相关的诱导系统
综上所述，作者开发的 HT - recruit 方法可用于量化转录效应子在不同环境下的功能，为系统理解转录调控机制提供了有力工具。许多转录效应子依赖于靶点和 DBD 环境，HLH 结构域可作为激活子或抑制子，KRAB 结构域是一种强效的抑制子。以此为基础构建的紧凑人源激活子 NFZ 可用于 CRISPRa，且比传统的激活子具有更好的病毒递送和诱导控制能力。筛选出了比传统ZNF10 KRAB 更强效的 KRAB 结构域（如 ZNF705 KRAB 和 ZNF471 KRAB），也可用于改进 CRISPRi 工具，提高其抑制效率和特异性。这些发现为开发更高效的转录调控工具提供了重要的理论依据和实验基础，有助于深入理解转录调控的复杂性，并为基因治疗、合成生物学等领域提供了新的思路和方法。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02442-6
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