课题1 DNA的粗提取与鉴定
一、基础知识
（一）提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）DNA的溶解性：
l DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
l 此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：
蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
（二）DNA的鉴定
在沸水裕条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
（一）实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
（三）去除滤液中的杂质
方案一 利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。
方案三 将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱保温10～15min，注意严格控制温度范围。
（四）DNA的析出与鉴定
1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。
实例：用鸡血细胞液粗提取DNA并鉴定（苏教版必修2）
步骤 | 操作 | 图示 |
1、提取鸡血细胞的细胞核物质 | 将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）5~10mL，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液。 | |
2、溶解细胞核内的DNA | 将物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液40 mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。 | |
3、析出含DNA的粘稠物
| 沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 | |
4、滤取含DNA的粘稠物 | 用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 | |
5、将DNA的粘稠物再溶解 | 取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 | |
6、过滤含DNA的氯化钠溶液 | 取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液（DNA溶于滤液中）。
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7、提取含杂质较少的DNA
| 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95％的酒精溶液50 mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。 | |
8、DNA的鉴定
| 取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。 |
三、操作提示
1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
四、课题成果评价
1、是否提取出了DNA
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。
2、分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。
3、不同实验方法的比较
对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的多少、颜色，二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
五、课题延伸
本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DAN时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。
【教材答案】
（一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。
5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
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