这篇论文的研究由Ahmed Sharaf及其团队完成，隶属于荷兰代尔夫特理工大学的精密与微系统工程系。研究成果发表在《Micro and Nano Engineering》期刊上。本文将详细介绍该研究的背景、过程、面临的挑战以及未来的研究前景。
随着生物医学工程和细胞生物学的发展，三维（3D）微结构的制造技术变得愈发重要。双光子聚合（2PP）技术因其高分辨率和可控性，成为制造复杂微结构的理想选择。这些微结构在细胞培养、机制生物学和疾病模型研究中具有广泛应用。然而，许多商业和自制的光敏材料在2PP过程中会产生高自发荧光，这对荧光显微镜分析造成了严重干扰，尤其是在细胞标记和成像时，荧光信号与自发荧光重叠，使得细胞的可视化和分析变得困难。
本研究旨在解决2PP制造的聚合物微结构的自发荧光问题，提出两种有效的抑制方法：紫外光漂白（photo-bleaching）和使用苏丹黑B（Sudan Black B, SBB）进行荧光猝灭。研究的核心是比较这两种方法在不同光敏材料（IP-L、IP-Dip、IP-PDMS和IP-S）上的效果，以确定哪种方法更优。研究团队使用了四种商业化的丙烯酸基光敏树脂，分别是IP-L、IP-Dip、IP-PDMS和IP-S。首先，设计了30x30x20微米的方形基座结构，以便进行自发荧光和机械强度的表征。然后，利用Nanoscribe GmbH的PPGT+ 2PP打印机进行微结构的打印。该打印机配备了脉冲飞秒光纤激光器，能够以高达50 mW的功率和780 nm的波长进行打印，具有极高的分辨率和可控性。
研究通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜对微结构进行表征，评估自发荧光的抑制效果。结果显示，紫外光漂白在不同材料上的自发荧光抑制效果为61.7%至92.5%不等，而SBB的抑制效果则为33%至95.4%。特别是对于IP-PDMS材料，SBB的效果较差，主要是由于其表面亲水性不足，导致SBB的附着不良。通过氧气等离子体预处理，显著提高了SBB在IP-PDMS上的附着力，从而增强了荧光猝灭效果。
为了验证所提出方法的有效性，研究团队使用人神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）进行细胞培养实验。细胞在处理过的微结构上培养并进行免疫荧光染色。结果表明，经过紫外光漂白处理的微结构在细胞可视化方面表现优于SBB处理的微结构，尤其是在细胞迁移和轴突延伸的观察中，紫外光漂白显著提高了细胞的可视化效果。
在研究过程中，团队面临了几个主要挑战。首先，自发荧光的复杂性使得不同材料的自发荧光特性各异，导致在选择合适的抑制方法时需要进行大量的实验和比较。其次，材料的亲水性与荧光猝灭剂的附着问题，尤其是对于某些材料（如IP-PDMS），SBB的附着效果不佳，影响了荧光猝灭的效果。通过表面处理来改善材料的亲水性是一个有效的解决方案，但也增加了实验的复杂性。此外，细胞实验的可重复性也是一个重要问题，细胞培养和染色过程需要严格控制条件，以确保实验结果的可靠性和可重复性。
本研究为细胞生物学领域提供了有效的自发荧光抑制方法，未来的研究可以在多个方面进行拓展。首先，探索新型低自发荧光的光敏材料，以减少自发荧光对荧光显微镜分析的干扰。其次，进一步优化紫外光漂白和荧光猝灭的处理条件，以提高其在不同材料和结构上的适用性。此外，将所提出的方法应用于其他类型的细胞和组织工程研究，以验证其广泛适用性。最后，探索将自发荧光抑制与其他成像技术（如超分辨率显微镜）结合的可能性，以提高细胞成像的分辨率和准确性。
阿赫梅德·沙拉夫及其团队的研究为解决2PP制造的聚合物微结构中的自发荧光问题提供了重要的见解和解决方案。通过系统比较紫外光漂白和SBB荧光猝灭的方法，研究不仅揭示了不同材料的自发荧光特性，还为细胞生物学的荧光显微镜分析提供了更为有效的工具。未来的研究将继续推动这一领域的发展，为细胞生物学和组织工程的应用提供更为坚实的基础。
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https://doi.org/10.1016/j.mne.2023.100188
