这篇论文的研究内容由美国莱斯大学的Anna-Karin Gustavsson及其团队完成，发表在《Nature Communications》期刊上。本文将详细介绍这项研究的过程、面临的挑战以及未来的前景。
单分子超分辨率荧光显微镜（SMLM）是一种强大的工具，能够在纳米尺度上研究细胞内多个亚细胞结构的分布和相互作用。然而，在对整个哺乳动物细胞进行单分子超分辨率成像时，通常会遇到高荧光背景和慢速采集速度的问题，尤其是在对多个目标进行三维成像时。这些问题限制了对细胞内部复杂结构的深入理解。为了解决这些挑战，研究团队开发了一种新的成像平台，称为soTILT3D，旨在通过结合微流体技术和单目标倾斜光片显微镜，克服上述挑战。研究团队希望通过这一平台实现更高精度和更快速度的三维单分子多目标超分辨率成像。
在技术创新方面，研究团队开发了一种可调节的、抖动的单目标倾斜光片，用于光学切片，以减少荧光背景。此外，他们还建立了一种三维纳米打印微流体系统，能够将光片反射到样品中。这种微流体装置的设计灵活，能够在不干扰高效和自动化溶液交换的情况下，集成反射光学元件。具体而言，研究团队使用了Nanoscribe的设备Photonic Professional GT2进行微流体芯片的纳米打印，这使得他们能够在微流体通道中灵活地设计和制造反射光学元件，从而实现高效的光学切片和成像。
soTILT3D平台结合了点扩散函数（PSF）工程、深度学习分析、主动三维稳定化和Exchange-PAINT技术，实现了高密度、三维的Exchange-PAINT成像。通过使用单一高数值孔径（NA）物镜，soTILT3D能够在整个细胞中进行光学切片，避免了多目标系统中的光学复杂性和相对漂移问题。研究团队利用深度学习算法DECODE对重叠发射体进行分析，显著提高了成像速度和精度。通过优化信号与背景比（SBR），soTILT3D能够在较低的成像探针浓度下实现高密度成像，从而减少了荧光背景，提高了单分子定位精度。
研究结果表明，soTILT3D平台在多目标三维单分子超分辨率成像中表现出色。与传统的广域照明（epi-illumination）相比，soTILT3D在信号与背景比方面提高了四倍以上，单分子成像的信号与背景比提高了六倍。通过对核膜蛋白lamin B1的成像，研究团队成功实现了低至8纳米的横向定位精度和12纳米的纵向定位精度。此外，soTILT3D还在成像速度上取得了显著提升，能够在较短时间内获取更多的定位数据，极大地提高了成像效率。研究团队通过对微管的成像，展示了使用DECODE分析的高密度数据与传统方法相比，定位数量的显著增加。
尽管soTILT3D平台在成像精度和速度上取得了显著进展，但研究团队仍面临一些挑战。首先，Exchange-PAINT技术需要在成像过程中进行多次溶液交换，这可能会影响成像的稳定性和精度。其次，尽管soTILT3D能够有效减少荧光背景，但在某些情况下，仍需进一步优化成像条件以提高信号质量。研究团队计划进一步优化该平台，以实现活细胞成像和单粒子追踪（SPT），并探索其在药物筛选和细胞环境控制中的潜力。
soTILT3D平台的成功开发为细胞生物学研究提供了新的工具，未来有望在多个领域得到广泛应用。随着新型荧光探针和自适应光学技术的发展，soTILT3D的成像性能有望进一步提升。研究团队还计划将该平台与其他成像技术结合，以实现更复杂的生物系统的研究。总之，soTILT3D平台的开发标志着单分子超分辨率成像技术的一次重要进步。通过结合微流体技术、深度学习和光学创新，该平台不仅提高了成像精度和速度，还为未来的细胞生物学研究开辟了新的方向。随着技术的不断进步，soTILT3D有望在理解细胞内部复杂结构和分子动态方面发挥重要作用。
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https://doi.org/10.1038/s41467-024-54609-z