叶绿素荧光成像在植物病害检测中的前景

植物病原体对农业和粮食安全构成了重大挑战。在这方面，包括光学方法在内的植物病害早期诊断技术正在积极发展中。本综述重点介绍其中一种光学诊断方法--叶绿素荧光（ChlF）成像。叶绿素荧光能够反映光合作用的活性，并对环境因素做出敏感的反应，这使其成为早期检测胁迫因素的理想工具，包括在病害症状出现前的阶段检测到病原体。在这篇综述中，我们分析了不同类型病原体（如病毒、细菌或真菌感染）以及疾病发展条件和严重程度对 ChlF 参数变化的影响。此外，我们还总结了在病原体与寄主植物相互作用过程中导致 ChlF 参数变化的主要机制。同时，我们讨论了 ChlF 成像与其他光学方法相比在病原体检测中的优势和局限性，以及如何提高 ChlF 成像在病原体早期检测中的灵敏度。

1、引言

植物病害由病毒、细菌和真菌感染引起，对农业造成重大损失。2015年至2022年，全球农作物因病原体减产4%，每年损失约2200亿美元。气候变化和新病原菌株的出现加剧了这一问题，室内种植农产品比例增加也增加了病原体风险。及时发现并控制病害爆发至关重要，早期诊断是精准农业的重要组成部分，可减少损失并提高农作物质量。开发抗病原体的植物新品种也是关键策略。传统的病原体诊断方法包括目测评估、形态参数评估、显微镜观察以及分子、血清和微生物诊断方法。光学方法如光谱成像、叶绿素荧光成像和热红外成像因其无创、定量评估可靠、信息含量高、分析速度快等特点而得到广泛应用。其中，ChlF成像是一种用于研究光合作用活动和评估植物健康状况的光学方法，具有巨大潜力。本综述旨在总结近期的研究，比较ChlF成像与其他病原体检测光学方法的效率，考虑如何提高使用ChlF早期检测病原体的效率，并分析其优势和局限性。

2、叶绿素荧光成像的基本原理

叶绿素荧光检测在生物研究中应用广泛，其中信息量最大的方法是采用脉冲-振幅调制（PAM）模式来记录荧光。叶绿素荧光检测在生物研究中应用广泛，其中信息量最大的方法是采用脉冲-振幅调制（PAM）模式来记录荧光。该方法通过高强度光照射叶片，测量荧光产量以确定光化反应的能量部分。从捕光复合体到光系统II反应中心迁移能量的效率是另一个重要组成部分，受类囊体膜上的pH梯度调控。测量过程包括对黑暗适应、低强度测量光、饱和脉冲和激活光化学过程的光的应用，计算出一系列叶绿素荧光参数如Fv/Fm、ΦPSⅡ和NPQ，反映光合作用装置的功能。这些参数对非生物和生物胁迫因子敏感。PAM荧光测量仪器的发展使得可以获得空间分布图像，特别适用于评估病原体对植物的影响。

图1 脉冲调制模式下叶绿素荧光登记的通用方案。

注：A、A−分别为氧化和还原电子受体；AL——光化光；LHC——光采集复合体；ML——测量光；PSII——光系统II；SP—sa

表1 叶绿素荧光参数及其在不同病原菌引起的植物病害检测中的应用。

表1 续表。

3、病原体引起的 ChlF 参数变化

3.1 病毒

在病毒诱发疾病发展过程中，ChlF参数的动态变化呈现出一定的规律。在病毒感染初期，ChlF参数可能会发生与光合作用激活相应的变化，表现为光依赖反应的有效量子产率增加和非光化学淬灭减少。随着疾病的进展，ΦPSII通常会下降，而NPQ则会上升。反映PSA（光合器官）完整性的Fv/Fm在相当长的时间内保持稳定，直到疾病晚期阶段才出现下降。在这些晚期阶段，NPQ也会上升，随后可能会下降。所有参数（Fv/Fm、ΦPSII和NPQ）的降低表明PSA出现紊乱，这是疾病严重阶段的典型表现。值得注意的是，ChlF参数的最初变化通常先于疾病的视觉症状出现。其中，NPQ和ΦPSII是较为敏感的指标。毒力较强的病毒株引起的变化幅度更大，发展速度更快；而对于毒力较弱的病毒株，改变的参数可能会因恢复而回到控制水平。同时感染多种病毒株的情况具有协同效应。

图2 PVX-GFP 感染的第十片烟叶在不同 DPI 下的图像：PVX-GFP — 荧光图像（λex 460 nm 和 λem 500–540 nm）

注：RGB- RGB 图像；psll-Psll 图像，在 AL 打开后 60 秒拍摄；NPQ-NPQ 图像，在 AL 打开后 40 秒拍摄；6 DP，对应于在研究叶片中检测到 PVX-GFP 的第一天。病毒含有 GFP 荧光蛋白，因此可以高精度地确定其定位。

3.2 细菌

细菌引起的ChlF参数变化通常表现为以下几种模式：接种区的细菌感染会导致光合作用受到抑制，Fv/Fm和ΦPSII下降。NPQ具有瞬时动态特征，最初增长后随即下降；同时，通常不记录增长阶段。在出现明显的细菌感染症状之前，就能观察到ChlF参数的变化。与病毒感染相比，这些变化之间的时间间隔通常较短，这可能是由于细菌引起的疾病进展速度较快。细菌数量越多，描述的变化发生得越快，其幅度也越大。在相邻的接种区也观察到类似的动态变化，变化开始的时间延迟，幅度较小。检查该区域的细菌含量证实，细菌是从接种区域转移过来的。在距离接种区较远的地方，即使没有细菌或细菌数量极少，ChlF参数也会发生典型的光合作用受抑制的变化，这与病原体毒素的释放有关。

图3 拟南芥叶片一侧（上部）感染了 GFP 标记的 P.syringae，叶片另一侧（下部）感染了野生型 P.syringae，两者的浓度均为 1x107CFU mL-1。

注：在 3、20 和 24 小时后，用 450 nm（GFP 标记的病原体成像）（A-C）或 365 nm（D-F）（酚类荧光成像）激发检测荧光信号，显示了相同时间点 PSII 的量子效率（G-I）和 PSII 的最大效率（Fv/Fm）（J-L）。

3.3 真菌

在分析真菌感染对植物ChlF参数的影响时，可以归纳出以下几个关键点。一般来说，真菌感染会抑制PSA的工作，这通常会导致所有光合作用参数（Fv/Fm、ΦPSII 和 NPQ）在病程中下降。同时，Fv/Fm在所有测量阶段都没有显著变化或变化很小。在疾病的早期阶段NPQ会升高，随后趋于平稳或下降。通常情况下，ΦPSII对真菌感染的敏感性最高，在接种后的头几天即症状前期就已下降。ChlF参数的典型变化模式出现在真菌感染植物根部的情况下，这种情况下病害会导致类似缺水的压力。

图4 接种了两种病原型条纹叶枯病菌的小麦 CM42 栽培品种的叶绿素荧光参数。

注：小麦 CYR32 和 V26。所示为接种叶片的图像。Fv /Fm ，ФPSII 光化学的最大效率（A）。NPQ，非光化学淬灭（B）。QP，光化学淬灭（qP = (Fm' - Ft')/(Fm ' - F0 )) (D). (D). 定量值（±SD）显示在每张荧光图像下方。CK，未接种的小麦植株。24-120 hpi 表示接种后 24、48 和 120 h。

病毒、细菌和真菌感染植物后，叶绿素荧光（ChlF）参数如Fv/Fm、ΦPSII和NPQ的动态变化具有一般模式和特殊特征。通常，这些参数的变化与光合作用活性下降一致，表现为Fv/Fm和ΦPSII降低，而NPQ在病害初期上升后下降。然而，病毒感染初期可能观察到与光合作用活性增加相对应的ChlF参数变化。细菌感染时也有类似变化，但更迅速且NPQ增长不明显。不同病原体导致ChlF参数的时间和空间动态变化具有特异性，受病原体类型、毒力、数量等因素影响。病变区域可能出现萎黄和坏死，导致ChlF参数异质性。根部感染时，叶片上ChlF参数变化无特征性空间模式。

图5 不同类型病原体引起的疾病进展过程中 ChlF 参数的动态变化。

注：虚线表示对照，红点为接种时间，实线为感染后的变化曲线，其中颜色代表感染程度。曲线反映了变化的规律，但不是定量值。

4、病原体诱导 ChlF 参数变化的生物学基础

病原体感染导致植物生理过程和组织结构变化，叶片颜色变化是典型迹象，表明光合器官（PSA）结构和功能紊乱。光合作用与其他生理过程密切相关，具有多级调节系统。病原体影响光合膜过程的途径多样，包括叶绿体结构、色素含量、暗阶段酶活性、ETC蛋白数量或结构变化等内部因素，以及二氧化碳输入限制、光合反应产物外流组成和速率变化、宿主植物免疫反应等外部因素。

4.1 叶绿体结构的变化

叶绿体结构主要受到植物病毒的直接影响。它们可以在细胞质和叶绿体基质中定位和繁殖，并伴随着质体形状和结构的变化。其中，定位于叶绿体周围细胞质中的烟草病毒 PMMoV-I 引起了烟草植物质体的肿胀和变形、嗜锇质体的积累以及叶绿体的片层结构和类木质膜的紊乱。作者认为，这些变化可能导致 PSII 功能障碍，并与感染后期的低 NPQ 值有关。在质体中复制的 PVX 会导致质体膜、类色粒的结构发生变化。另一种波替克斯病毒 BaMV（竹子花叶病毒）能与叶绿体磷酸甘油酸激酶（cPGK）结合，也有类似作用。这些病毒与叶绿体蛋白相互作用，诱导形成膜囊泡，病毒在其中复制。其他类型的病原体，如真菌，也能影响叶绿体的超微结构（颗粒堆积和类囊体结构松弛），从而抑制光合作用。

4.2 色素含量的变化

叶片黄化是植物病害的典型症状，主要由病原体导致的叶绿素含量减少引起。这种现象在多种植物和病原体组合中被证实，包括感染木薯普通花叶病毒（CsCMV）的木薯、奥布达辣椒病毒（ObPV）的辣椒、PEMV的豌豆以及Botryosphaeria dothidea真菌的杨树等。在这些研究中，叶绿素含量的减少通常伴随着光合作用活性参数（ChlF）的变化，表明光合作用受到抑制。黄瓜花叶病毒（CMV）通过RNA干扰影响烟草镁螯合酶亚基I的mRNA，导致严重的叶绿素缺失。细菌和真菌感染也会改变色素组成，例如小麦条锈病显著降低小麦叶绿素含量并伴随Fv/Fm下降，Peronospora plantaginis导致车前草叶绿素a和b含量下降。通过比较叶绿素含量与ChlF参数的动态变化，可以确定病原体引起的叶绿素变化是否是ChlF参数变化的原因。研究表明，色素含量减少与ChlF参数变化同时发生，特别是在病毒感染和真菌感染的情况下。然而，也有研究显示色素含量减少可能晚于PAM参数变化，表明在这种情况下，色素含量变化不是调节ChlF参数的因素。除了叶绿素外，类胡萝卜素含量也有所减少，这可能与非光化学淬灭的变化有关。

4.3 ETC 蛋白质的变化

病毒能够影响叶绿体的 ETC 蛋白，导致线性电子传递受到抑制。这表现为PSII的最大量子产率和有效量子产率下降，非光化学淬灭（NPQ）上升。特别是，豌豆PEMV感染会导致OEC的破坏；然而，OEC破坏并不是疾病发展早期ΦPSII主要减少的原因。在木薯植株感染CsCMV期间，OEC活性降低。烟草感染tobamovirus后会影响OEC的蛋白质组成，导致PsbP/PsbO蛋白质比率急剧下降。病毒感染还会选择性地影响不同形式的PsbP的积累，这种影响在感染了不同病毒的植物上都能观察到。PSII复合物的其他蛋白质也可能成为病毒感染的目标。例如，在SuCMoV诱导的Helianthus annuus L.病害发展初期，观察到蛋白D1（PSII反应中心蛋白，PsbA）含量下降，这种下降与Fv/Fm和ΦPSII的下降相关。此外，病毒感染还会导致编码叶绿体ETC蛋白的基因表达下调。细菌和真菌感染也主要导致编码叶绿体ETC蛋白的基因表达下调。例如，念珠菌导致拟南芥中编码叶绿素a/b结合蛋白的基因cab的表达受到抑制。对感染了P. syringae的烟草中PSI和PSII蛋白质的含量和功能活性的直接评估显示，PsbO、D1和PsaA降解，同时ChlF参数Fv/Fm和RC/CSm（反应中心密度）下降。纹枯病菌诱导小麦中D1和CP29蛋白发生变化，同时Fv/Fm和ΦPSII下降，NPQ上升。研究还表明，D1蛋白的下降可能与NPQ的增加同时发生（48和120 hpi），并先于Fv/Fm的下降（120 hpi）。分析了拟南芥中由P. syringae诱导的非调控能量损失（Y(NO)）和Fv/Fm的变化，结果表明病原体对PSII有直接影响，表现为对ETC成分的不可逆损伤。

4.4 不依赖光的光合反应酶活性的变化

光合作用中依赖光的反应产物（ATP和NADPH）主要在卡尔文-本森循环中消耗，因此卡尔文-本森循环活动的变化会快速影响ChlF参数。感染期间CO²同化作用的下降是降低整个光合作用过程效率的关键因素之一。受PEMV感染的豌豆、受CsCMV和CBSD感染的木薯、受PVY感染的烟草、受TYLCV感染的番茄等都出现了二氧化碳同化减少的现象。同时，统计意义上同化强度的显著下降可能晚于ΦPSII和NPQ的变化，这可能表明该系统中同化强度的下降不是ChlF参数变化的原因。卡尔文-本森循环的CO2同化强度和效率受到核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧合酶（RuBisCO）活性的限制，该酶是病原体攻击的目标之一。病毒可通过噬菌体蛋白对这种酶产生直接的异位抑制作用。在真菌和细菌感染的情况下，rbcS基因表达分别在6-7 dpi和4小时内受到抑制。因此，RuBisCO可能是植物病原体感染的主要靶标之一。

4.5 基质限制和气孔闭合

卡尔文-本森循环的高活性必须得到持续流入的二氧化碳的支持。作为防御机制的一部分，植物对感染的典型反应之一就是关闭气孔。感染通常会导致气孔关闭，进而导致二氧化碳供应减少。气孔在细菌和真菌感染的情况下尤为重要，因为细菌和真菌孢子主要通过气孔进入植物体内。这一过程主要通过РAМР（MAMP）识别系统发挥作用。禾本科镰刀菌、N. tabacum 和 P. nicotianae感染的T. aestivum L.都证明了气孔闭合。在后一种情况下，感染病灶中开放气孔的百分比和气孔对水的传导率在最初6 hpi强烈下降，但在感染后期又再次上升。病原体诱导的气孔限制可能有不同的机制。化学性质不同的 РAMPs，如flg22、elf18、细菌脂多糖、甲壳素、酵母诱导剂和低聚半乳糖醛酸，都能诱导气孔关闭。病毒感染也会导致蒸腾作用减弱，但与真菌或细菌感染相比，病毒感染发生得较晚。这可能表明，在病毒感染的情况下，气孔导度限制对ChlF参数的早期变化影响较小。

4.6 长途运输变化

与底物（二氧化碳）流入同时进行的不依赖光的反应的活性取决于产物流出的速度。在这方面，病原体对同化物运输的影响是病原体影响 ChlF 参数的另一种方式。主要是感染导致淀粉含量（减少）和可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖和果糖）含量（增加）的变化。病毒、细菌和真菌感染都会引起这种变化。受感染叶片光合速率的异质性可能是病原体引起的源-汇关系变化的结果。许多研究表明，相容交互作用中的一个关键事件是病原体诱导的宿主细胞质转化酶（细胞壁相关）活性刺激，这导致己糖通量的积累和/或改变，并在某些情况下导致叶片蔗糖输出减少。人们普遍认为，可溶性糖的局部积累有助于病原体的营养。研究表明，病原体（真菌和细菌）在维管束系统中的定位可能会造成韧皮部束缚，抑制糖的向下运动，导致糖在叶片中积累，并由于负反馈作用而抑制整体光合作用。

4.7 寄主植物的免疫反应，包括氧化过程和激素调节

病原体感染会影响植物的光合作用过程，其中一个重要的影响方式是对同化物运输的影响。与底物（二氧化碳）流入同时进行的不依赖光的反应的活性取决于产物流出的速度。在这方面，病原体对同化物运输的影响是病原体影响ChlF参数的另一种方式。主要是感染导致淀粉含量减少和可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖和果糖）含量增加的变化。病毒、细菌和真菌感染都会引起这种变化。受感染叶片光合速率的异质性可能是病原体引起的源-汇关系变化的结果。许多研究表明，相容交互作用中的一个关键事件是病原体诱导的宿主细胞质转化酶活性刺激，这导致己糖通量的积累和/或改变，并在某些情况下导致叶片蔗糖输出减少。人们普遍认为，可溶性糖的局部积累有助于病原体的营养。研究还表明，病原体在维管束系统中的定位可能会造成韧皮部束缚，抑制糖的向下运动，导致糖在叶片中积累，并由于负反馈作用而抑制整体光合作用。

图6 病原体对 ChlF 参数的影响途径。

5、注册模式的优化

ChlF成像在早期检测植物病原体方面具有高效性，开发特殊登记方案可提高其灵敏度，专门设计的方案比标准方法检测不同类型病原体效率更高。优化方案关键在于选择开启致光灯后记录ChlF参数的时间，光照开始3 - 5分钟内电流强度和ChlF最大值变化至稳态水平（ss），ΦPSII从最小值升至ss水平、NPQ先升后降再缓慢升至ss值，达到ss意味着光合作用中光依赖与非光依赖反应在ATP和NADPH方面开始平衡。图7体现了感染PVX病毒的烟草病叶组织和健康叶片组织的显著差异及光照时间间隔的影响。早期对感染PMMoV - I病毒的N. benthamiana植物测量模式优化发现，光照20秒后无症状感染叶片NPQ图像与对照叶片NPQ图像对比度大于ss条件下。研究证明瞬时ChlF参数可成功检测病毒早期阶段，因病毒对植物ChlF参数影响弱且慢，如N. benthamiana - PVX系统中瞬态参数可更早检测病原体。瞬时ChlF参数在检测细菌感染方面效率也高，不过部分研究有相反结果，如检测葡萄疫原体时光适应（ss）条件下Ppsll图像对比度最高。记录方案改进包括最佳记录时间和特定光照条件，研究显示修改测量方案可更早区分感染和健康叶片。总之，制定特定ChlF检测方案提高PAM成像在病原体检测中灵敏度意义重大，针对特定病原体 - 宿主 - 植物系统优化方案可缩短检测时间、提供更多交互信息。当前测量方案优化有限，无法对现有方案效率排序，但可明确优化ChlF登记方案原则，如登记瞬态参数、选择光照强度、使用周期性光照，最佳值范围需更多实验结果确定。

6、PAM成像与其他植物病原体检测光学方法的比较

要分析PAM成像在植物病原体早期检测中的效率，需明确其在其他光学方法中的地位。多种光学技术如RGB成像、ChlF成像、热红外成像、多光谱和高光谱成像已用于植物病害检测，光学方法因具有非侵入性、高灵敏度、分析速度快、可自动获取和处理图像且成本低等优点在农业中广泛应用。除PAM成像外，TIR和HS成像也是常用的早期检测方法，但单项实验研究中直接比较不同光学方法检测效率的著作较少，且病原体检测效率受病原体 - 寄主系统和疾病发展速度相关因素影响。对PAM和TIR成像，二者结合用于研究不同病原体影响，在对N. benthamiana植物受PMMoV - S和PMMoV - I株系影响的研究中，热成像比PAM成像更早检测到感染，在检测I. batatas中的病原体时也有类似情况。在细菌、真菌感染的研究中，也对比了温度变化和ChlF参数变化，不同情况各有先后。在研究接种CMV、CGMMV和白粉病真菌的黄瓜植株反应时，表明ChlF参数能更早发现病害，但HS分析用的是标准植被指数。在烟草 - PVX系统中，比较了ChlF参数和归一化反射率指数，ChlF参数灵敏度更高。在小麦穗受镰刀菌影响的研究中，PAM比HS成像能更早检测病原体，PAM荧光测定法直接测量光合作用活性，HS成像记录叶片组成和结构变化。PAM成像虽灵敏度高，但ChlF成像特异性不强，其参数受多种胁迫因素影响，可通过分析参数变化的空间模式解决，不过某些病原体的影响与非生物胁迫因素难区分。总之，PAM成像是有效的植物病害早期检测方法，ChlF成像有优势也有局限，其灵敏度与TIR相当，与光谱成像相比潜力较高，但HS成像特异性更高。

表2 成像技术在植物病原体检测中的适用性。作者根据以下内容进行了总结。

7、结论

回顾ChlF成像在病原体检测中的应用，其有高灵敏度和信息含量，能评估正常和病理状态下生理活动，可在无症状阶段检测感染，能确定病原体空间分布、监测感染区域扩展速度和评估疾病进展。但该方法也有局限，单次测量持续时间长且需暗适应，区分疾病潜力较低，ChlF参数变化与疾病严重程度和发展时间关系更密切。ChlF成像优势和局限决定其更适合用于选择抗病品种而非精准农业，在培育新品种时，其高信息含量、灵敏度和对单个对象测量的可能性克服了其在持续时间和特异性方面的不足，在育种研究中的潜力已被多项研究证实。该方法的进一步改进和广泛应用需开发获取和处理观察结果的工具、优化测量方案、改进图像分析方法、建立光吸收和发射模型。它与光谱、TIR成像技术结合，使用荧光标记病原体和荧光报告物可提升其价值，随着相关研究发展，ChlF成像技术将为早期检测病原体、监测保护策略效率、获得抗病品种创造机会，为形成病原体 - 宿主 - 植物相互作用完整图景做贡献。

戳这里，阅读原文