研究植物与病原体相互作用的显微成像依赖于侵入性组织学技术，如清除和染色，或者在体内成像依赖于复杂的转基因病原体的产生，因此受到限制。本文采用无标签光学相干断层扫描技术实时三维可视化病原体动态。基于本征信号波动作为组织对比，在植物组织中三维成像丝状病原体和线虫。分析了莴苣霜霉病感染(Bremia lactucae)的三维图像，获得了三种不同抗性水平的不同基因型莴苣的菌丝体积和长度，显示了精确(微观)表型和感染水平定量的能力。此外，本文展示了单个病原体(亚)结构生长的体内纵向成像与病原体微活动的功能对比，揭示了病原体的活力，从而为潜在的分子过程打开了一扇窗。
图1 动态OCT (dOCT)成像。A. dOCT成像过程概述：获取一系列B扫描，并对每个像素的振幅随时间进行傅里叶变换以获得振幅谱。三个频带的平均光谱幅度的对数提供了导致RGB假彩色dOCT图像的三种颜色的强度。对于平行帧重复此操作，可以获得捕获菌丝3D结构的体积图像，如线条图所示(也表明xyz几何形状)。B. 莴苣叶片的dOCT水平横切面显示菌丝和吸器侵入海绵状叶肉细胞(上)，植物抵抗乳酸菌感染导致海绵状叶肉细胞死亡(中)，表皮细胞和植物气孔(下)。图像的最大强度投影(MIP)分别大于7 μm、4 μm和1.4 μm。C. 差示干涉对比显微镜和dOCT对活孢子和死孢子的比较(以N > 10个活孢子和死孢子为例)。补充影片1显示了散射物和OCT散斑的运动。箭头表示胚芽管。D. 同一样品的常规OCT图像、dOCT图像和台锥蓝染色明场显微镜图像的全轴向MIP，证明dOCT可以在植物叶片内标记无标记的乳杆菌菌丝图像(N = 3个重复的例子)。E. 拟南芥叶肉组织中霜霉病感染和辣椒根部根结线虫感染的动态OCT图像(水平横截面，MIP深度超过4 μm)。
图2 动态OCT的微观表型。A. 动态OCT (dOCT)成像过程的概述。B. 动态OCT体积分割管道。图像是最大强度投影(在阈值之前)或非零像素的轴向和(在阈值之后)。所有图像段经过三维高斯滤波和阈值去除小物体后的图像。C. 基于dOCT的各基因型每体积乳酸杆菌感染程度定量(每个基因型N = 16，采用双侧Mann-Whitney U检验进行统计学分析***p < 0.001)。D. 三种基因型相对致病菌DNA含量的qPCR数据。E. 每种基因型的三个典型水平dOCT横切面上有菌丝。
图3 病原体生长的纵向成像。A. 通过高斯滤波乳酸乳杆菌对比图像的最大强度投影(MIP)显示两天内乳酸乳杆菌感染的进展情况。B. 乳酸双歧杆菌菌丝的分节点云，以生长时间为颜色。C. 随着时间的推移，三个不同叶段的乳酸芽孢杆菌菌丝总量增加(一个在(a)中)。D. 在新的活性菌丝发育时失去活性的菌丝特写(白色箭头)。上图为高斯滤波后的乳酸菌造影剂的MIP，下图为菌丝深度处的水平截面dOCT图像。E. 两张相隔40分钟的照片的特写，以及15小时后的放大照片。箭头表示新生长的菌丝，白色虚线框表示前两幅图像的区域。
de Wit, J., Tonn, S., Shao, MR. et al. Revealing real-time 3D in vivo pathogen dynamics in plants by label-free optical coherence tomography. Nat Commun 15, 8353 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52594-x
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王春颖
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