第一作者：Yu Huang
通讯作者：Jianming Xu
通讯单位：浙江大学土水资源与环境研究所
Doi：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.135981
图文摘要
摘要
稻田土壤中，砷（As）的胁迫影响着氮（N）的转化，同时水稻种植期间氮肥的施用也会影响砷的转化。然而，淹水稻田土壤中砷与氮之间的交互作用对氮有效性和砷活性的具体影响尚不清楚。在此，本研究分别设置了4个As污染水平（0、30、80和150 mg kg−1）和3个尿素添加水平（0、4和8 mmol N kg−1）以探究N和As的动态变化。其中，As污染会显著抑制固氮菌(nifH)和真菌，但会促进氨氧化古菌和反硝化功能基因（narG、nirK、nirS），进而降低溶解有机氮、铵态氮和硝态氮的浓度。此外，尿素的施加刺激了砷和铁还原菌（arrA和Geo）与厌氧氨氧化（anammox）的耦合。以培养的第28天为例，与无氮添加对照相比，添加8 mmol N kg–1尿素会使30和80 mg kg–1 As处理下土壤溶液中总砷浓度提高2.4和1.8倍；而在150 mg kg–1 As处理下，尿素的施加促进了土壤中As(III)氧化和NO3–-N还原间的耦合，使土壤溶液中总As浓度降低了63%。上述结果表明，As污染降低了氮的可利用性，但尿素的施用会影响As的活性，同时其影响取决于土壤As污染水平。
引言
砷（As）广泛分布于多种环境中，但由于人类活动的影响使它可在稻田土壤中诱发严重的污染。土壤氮素（N）转化作为调控氮的有效性的重要过程，它对As胁迫极为敏感。氮是水稻生产中主要的限制性营养物质之一，每年大量的氮肥被施用于稻田土壤以维持水稻生产力。施氮后土壤理化性质以及氮转化过程的变化也直接或间接地与 As 转化耦合，影响 As 的活性。因此，了解淹水稻田土壤中 As 和 N 转化之间的相互作用对于实施生产管理措施以降低 As 对水稻生产、籽粒品质和环境威胁至关重要。
方法
试验基于4个As污染水平和3个尿素添加水平的完全随机设计，每个处理设置3重复。培养期间依据培养时间梯度共进行7次采样，共采集336个样本。在土壤中加入Na2HAsO4溶液以达到添加砷的含量为0 (As0)、 30(As1)、80 (As2)和150 (As3) mg As kg−1土壤。上述土壤砷污染水平为《中国土壤污染风险管控标准农用地土壤污染风险筛选值和管制值》中酸性水田土壤（5.5 < pH≤6.5）的风险筛选值及管制值。另外在土壤中添加0 (N0)、4(N4)和8 (N8) mmol kg−1 N（干土）3个N水平的尿素溶液。其中N处理4和8 mmol kg−1 N干土相当于100和200 kg N ha−1。在中国长江三角洲中高产水稻田，氮肥施用量约为200 kg N ha−1。在实验中，每一个重复样品含有30克土壤用于破坏性取样。土壤样品均放置于玻璃瓶里，并在25℃的黑暗条件下中进行培养。
受试土壤在60%最大持水量条件下老化45天后，每份加入30毫升MiliQ水使其达到淹水状态后预培养7天。而后加入尿素与土壤混合，并加入20毫升MilliQ水。每个瓶子均用透气组培封口膜进行封口以减轻外界环境的干扰。为维持淹水条件，定期添加MilliQ水以弥补水分损失。在培养过程中，采集第0、1、3、7、14、28和56天的土壤、土壤溶液和气体样品来评价生物地球化学性质的变化。
主要结果
砷对土壤氮素的影响
本研究发现As胁迫降低了土壤溶液中溶解性有机氮、铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3–-N）的浓度 (图2-3)，这表明As胁迫对不同氮素转化过程的影响不同，进而最终导致土壤氮素有效性的下降。本研究将上述结果归因于As胁迫下：1）As对N固定与矿化的抑制效应；2）微生物的解毒对N需求的增加；3）As(III)氧化和与NO3–-N还原耦合的强化。
图2 土壤溶液中溶解性有机氮浓度和氧化亚氮排放速率的变化
图3 土壤溶液中铵态氮和硝态氮浓度的变化
砷（As）在进入细胞后会与有机质中的巯基结合，影响细胞的生理机能与酶活性。因而对微生物而言，同化活性氮素（例如溶解性有机氮和NH4+-N）以合成解毒底物是应对As胁迫的重要机制。同时，难矿化有机质主要分解者真菌（表1）和固氮功能基因（nifH，Fig. S5）丰度均受到As胁迫的显著抑制，而氮素矿化和固氮过程的抑制会降低土壤中的活性氮素（labile N）。因而砷胁迫下，微生物解毒对氮素需求的增加以及氮素矿化和固氮过程受抑制是造成As污染土壤溶解性有机氮和NH4+-N含量下降的主要原因。
通常，反硝化是淹水状态下的主要氮素转化过程。而本研究发现，As污染提高了土壤Eh并降低了土壤pH（Fig. S1）。由于氨氧化古菌（AOA）具有相较于氨氧化细菌（AOB）更强的（类）重金属抗性，及其对较低土壤pH值的偏爱，上述土壤条件将有利于以AOA为主的氨氧化过程（表1，Fig. S4）。因而上述过程是致使土壤NH4+-N含量随As污染程度增加而下降的另一诱因。然而，本研究中NO3–-N作为硝化过程的产物同样随As污染的提高而降低。在淹水条件下，As(III)氧化与NO3–-N还原耦合是普遍存在的As-N耦合过程。在厌氧环境中，As(III)氧化为As(V)以及NO3–-N还原为NO2–-N两个过程均受微生物所介导。在As污染土壤中，受激发的As(III)氧化功能基因（aioA，表1）促进了As(III)作为电子供体转化为As(V)的解毒过程（图4）。硝酸盐还原功能基因的强化表达（narG，表1）也促进了电子受体NO3–-N的还原。此外，NO2–-N作为NO3–-N还原过程的产物，也同样是异化硝酸盐还原为铵态氮（DNRA）的底物。在As胁迫下，微生物解毒对NH4+-N需求的增加可能会间接地促进NO3–-N消耗。因此，As(III)氧化与NO3–-N还原的耦合，微生物对NH4+-N需求的增加以及上述NH4+-N供给的受限一同导致了NO3–-N含量随As污染增加而下降。
表1 各处理下土壤主要功能基因的绝对丰度
如上所述，淹水As污染稻田中普遍存在的As-N耦合过程有利于将NO3–-N还原为亚硝酸盐还原的底物NO2–-N。在淹水稻田土壤中，亚硝酸盐还原是产生N2O的主要过程，且主要由功能基因nirK和nirS所介导。在土壤培养期间，As胁迫显著提高了nirK和nirS的相对丰度（Table S3）。因而，As-N耦合过程供给的充足底物加之nirK和nirS功能基因的强化表达共同促使了培养第28天受As污染土壤N2O产生速率的显著增加（图2B）。
尿素的添加同时增加了N2O产生速率以及累积的N2O产生量，且增加的幅度在高As污染稻田土壤中更大。其中，在最高As和N处理下（As3N8）N2O产生速率和产生量增加最为显著，这可能是As胁迫下异养硝化作用的增强所致。本研究中，As污染导致的AOA丰度和Eh的增加以及pH值的下降均有利于异养硝化过程，同时受As抑制的N矿化和同化还会相对增加异养硝化过程所需的底物供给，进一步促进该N2O产生过程。值得注意的是，在高As污染土壤中，施氮后N2O排放量的增加对应着土壤溶液中活性氮素（溶解性有机氮+NH4+-N+NO3–-N）的降低。总的而言，本研究表明As污染条件下，1）As对N矿化和固定的抑制；2）微生物解毒对N需求的增加；3）As-N耦合的增强共同导致了更强烈的氮素的流失以及更低的氮素有效性。
尿素对砷转化和活性的影响
本研究发现，尿素的施用在培养期前14天内促进了As(V) 的还原并提高了各As处理条件下土壤溶液中As的含量（图4），而尿素施加效应在不同As处理间的差异主要于培养28天后显现。其中在土壤培养的第28天，施氮增加了As1和As2处理下土壤溶液中总As和As(III)的含量，但降低了As3处理的总As和As(III)含量。基于冗余分析发现（图5），不同含As污染水平土壤的土壤溶液中As含量的变化由不同的生物地球化学因子所调控。因此我们猜测，尿素对As迁移转化过程的影响与As污染程度有关。
图4 土壤溶液中三价砷、五价砷和总砷浓度的变化
本研究发现，尿素施加后主要是通过NH4+-N、Fe(II)和相关微生物（arrA、Geo）等因素的驱动，增加了As1和As2处理下土壤溶液中As、As(III)和As(V)总量的含量（图5、Fig. S8A）。尿素在进入土壤后首先会脲酶被水解为NH4+-N，而后由其直接通过厌氧氨氧化过程促进As还原（arrA）（表1，图S8A），进而促进As(V)向活性更强的As(III)的还原转化。同时在厌氧条件下，生物NH4+-N氧化与Fe(III)还原溶解耦合（铁氨氧化过程，Feammox）是As释放的关键机制。通常，厌氧氨氧化会通过与铁氨氧化过程Fe(III)和As(V) 还原耦合，促进含As铁矿物的溶解。因此，NH4+-N的铁氨氧化过程强化了arrA和Geo的表达（表1，Fig. S7），导致土壤溶液中As(V)和As(III)的增加，同时也导致土壤溶液中Fe(II)的增加。此外，施用尿素还导致As1和As2处理土壤第28天pH值的增加和Eh的降低。pH值升高会增加土壤矿物（主要是铁锰氧化物）表面的负电荷，进而促进As(V)的解吸。此外，其他基于大田实验的研究结果表明，土壤Eh的降低能进一步诱导As(V)从铁矿物上的释放，而本研究中的土壤Eh同样与As有效性呈负相关（Fig. S8A）。因此，尿素施加后土壤pH和Eh的变化同样是调控低、中度As污染土壤As活性的重要因素。
图5 冗余分析结果（A，As1和As2处理；B，As3处理）
值得一提的是，在培养28天后，施氮对As3处理下土壤溶液中总砷和砷(III)含量的影响与As1和As2处理相反，而这主要受到pH、Eh、Fe、Mn、aioA和硝化和反硝化相关微生物等的调控（图4）。首先，尿素施加28天后降低了As3土壤的pH，但提高了土壤Eh。通常，pH降低和Eh升高有利于As(III)氧化为As(V)，促进As在铁锰氧化物中的吸附。其次，与As1和As2相比，施氮后As3的Eh值相对较高（均超过−160 mV）（Fig. S1），显著刺激了AOA（表1）并促进了AOB的恢复（Fig. S4）。这将有利于为NO3–-N还原提供底物供给并促进其与As(III)氧化的耦合。由于As(V)与土壤铁锰氧化物具有较强的亲和力，因而大量As(III)被氧化为As(V)后，势必将促进As与铁、锰的共沉淀，并降低了As3处理下土壤溶液中铁、锰的浓度（Figs. S2, S8B）。
在As污染稻田土壤的安全利用过程中，降低稻米中的As含量以达到政府的安全限值是首要目标。同时，对促进水稻生产和农业绿色发展并降低环境的影响而言，提高氮素利用效率至关重要。据Chen等的报道，施用硝酸盐肥料能促进As(III)氧化为活性较低的As(V)，进而降低稻谷中砷的含量。因此，对于As含量低于80 mg kg−1的受As污染稻田而言，硝基肥是比铵基肥更好的选择。考虑到硝基肥施加会促进NO3–-N还原与As(III)氧化的耦合，进而刺激反硝化作用，因而选择以反硝化抑制剂（如原花青素）作包衣的肥料能更有效地增加N的利用效率并减少氮素损失。此外，对于As污染程度较高的土壤（本研究中为150 mg kg−1As的处理），尿素是降低籽粒砷含量并同时减轻环境影响的理想肥料选择。
小结
本研究阐述了As×N相互作用在调控淹水砷污染稻田土壤中氮有效性和砷活性的重要作用。As胁迫下NO3–-N还原与As(III)氧化间耦合的强化以及氮素固定和矿化的抑制一同增加了氮素损失，并降低了土壤氮素有效性。在低、中度砷污染的稻田中，施氮强化了As(V)还原与厌氧氨氧化的耦合并促进了As土壤矿物上的解吸，进而增加了土壤中As的活性。在相对较高的砷污染土壤中，施加尿素会促进As(III)氧化与NO3–-N还原耦合，降低As的活性。鉴于土壤自身生物地球化学过程与淹水中As、N的转化过程的复杂性，本研究发现尿素对稻田土壤As活性的影响取决于As的污染程度。这些结果表明，在受污染稻田实施配方施肥策略能够减少作物对As的吸收并降低二次污染的风险。
通讯作者简介
徐建明，浙江大学求是特聘教授，长期从事土壤质量与过程、土壤污染控制与修复等领域的研究，主持完成国家自然科学基金创新研究群体项目及重点项目、国家重点研发计划项目等，在Nature及子刊、PNAS、ISME J、Microbiome等国际学术刊物发表SCI论文400余篇。曾获国家杰出青年基金，被聘为教育部长江学者特聘教授，当选美国农学会、美国土壤学会、中国土壤学会会士。
文章链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389424025603
