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线粒体在细胞能量代谢及各种生物调控过程中的作用至关重要，其功能失调与多种疾病密切相关。传统的混合细胞水平线粒体DNA (mtDNA) 测序常常掩盖单个细胞中的信息，导致对线粒体遗传学的理解有限。相比之下，单细胞mtDNA测序能够在单细胞层面精准检测和表征mtDNA突变，为线粒体异质性及其动态提供了更深入的视角。本课题组和中山大学徐锦教授的这篇综述总结了当前单细胞mtDNA测序的主要方法，并探讨其在推进线粒体遗传学理解方面的应用。
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上图展示了两种细胞群体，尽管它们的平均变异等位基因频率（VAF）相同，均为0.25，但其变异及功能影响可能显著不同。在第一组中，四分之一的细胞表现出纯合性突变，而其余细胞仅含有野生型mtDNA。相反，第二组细胞群体中100%的细胞均存在约25%的异质性。尽管两种情况的VAF均为0.25，但在组织层面的功能后果可能有显著差异。第一种群体，由于纯合突变的局部存在，可能导致显著的组织效应；而第二种群体，其异质性在所有细胞中广泛分布，带来的组织功能影响则较为微弱。因此，检测mtDNA突变需要达到单细胞分辨率，以提供精确的功能动态洞察。![]()
表2概述了当前单细胞mtDNA测序主要方法的建库策略及性能：![]()
下一代测序（NGS）和第三代测序（TGS）平台已被应用于线粒体基因组分析。NGS因其广泛应用及成熟的操作流程，仍然是主要策略。TGS其主要优势在于能够捕获连锁信息和解析单分子序列能力，从而对mtDNA进行详细的变异分析。第三代测序平台通过长片段DNA测序能力转变了mtDNA分析策略。这些平台可以捕获全长mtDNA序列，这对于进行变异表征和完整的单倍型解析尤为重要。在这一领域的一项重大进展是使用UMI标记单细胞中的mtDNA分子。在UMI标记后，进行高保真长片段PCR扩增，并通过长读长平台对扩增产物进行测序。此方法克服了传统NGS的局限性，增强了mtDNA测序的准确性和深度。获得全长mtDNA序列并解析个体单倍型的能力对于研究线粒体异质性和遗传模式具有极高价值。![]()
线粒体基因组的大部分区域对线粒体的基本功能至关重要。mtDNA异质性水平的变化会导致不同的细胞表型。体细胞mtDNA突变通常表现为异质性，其中突变等位基因的频率显著影响单细胞线粒体功能。理解不同细胞中的异质性变化，并识别影响这些动态的因素，是单细胞基因组时代线粒体遗传学的核心内容。随机遗传漂变是一种进化机制，导致群体中等位基因频率因随机采样效应而发生变化。此过程可能导致遗传变异的丧失，并在若干代之后使特定等位基因固定。在小群体中，随机事件对等位基因频率的影响尤为显著。相同的随机过程也影响单个细胞中mtDNA突变频率。当新的突变出现在单个mtDNA分子中时，它可能发生随机漂变，导致突变拷贝数增加或减少，而与突变效应无关。在这一背景下，mtDNA拷贝数类似于群体大小，决定了随机遗传漂变的影响力。特别的是，与自然群体中的单一或有限数量的群体不同，mtDNA突变可以在大量后代细胞中观察到。较低的mtDNA拷贝数使后代细胞中的异质性变化较大，从而异质性频率的方差可作为评估mtDNA遗传瓶颈影响的指标。在卵母细胞发育和胚胎早期发生的遗传瓶颈是一种显著现象，显著减少了mtDNA拷贝数。该瓶颈可能作为一种质量控制机制，通过筛选出有害突变以防止其积累。同样，单细胞mtDNA测序显示，体细胞中也存在遗传瓶颈。例如，淋巴细胞中体细胞纯合性mtDNA突变的过度表达表明体细胞中可能存在类似的mtDNA质量控制机制。除了遗传漂变，细胞选择过程也会影响mtDNA突变动态。研究发现，致病性mtDNA突变在特定细胞类型中表现出细胞选择特异性。在细胞水平上的遗传瓶颈和净化选择之外，遗传变异的顺式效应也会影响mtDNA的扩增和质量控制，进一步影响其自身的动态变化。例如，某些突变的mtDNA可能比野生型mtDNA更有效地复制，从而增加突变mtDNA的比例。相反，一些突变可能导致复制效率降低，随着时间的推移其相对比例减少。此外，线粒体质量控制系统（包括线粒体自噬）可以影响mtDNA突变的频率。当突变导致线粒体功能障碍时，质量控制机制可能被激活，选择性地降解含有缺陷mtDNA的线粒体。这一过程会影响细胞内的总mtDNA拷贝数和异质性频率。![]()
由于mtDNA突变率高且易于读取，mtDNA变异是一类理想的内源性遗传标记，可用于谱系追踪。早在单细胞基因组学兴起之前，便有研究提出利用mtDNA突变进行谱系追踪。近期研究已证明，体细胞mtDNA突变在有效读取后可用于构建细胞之间的谱系关系。这一方法在人体免疫细胞中得到验证，突显了mtDNA变异作为天然遗传条形码用于谱系追踪的潜力。单细胞测序中对混合样本进行拆分可以通过外源性或内源性标记实现。外源性标记通常使用带有核苷酸序列的抗体。然而，当前“通用抗体”的特异性往往不足，导致某些细胞类型丢失。此外，标记过程需要反复离心和洗涤步骤，可能损害细胞活性。相比之下，内源性标记方法利用个体间的遗传变异进行样本拆分。线粒体变异在单细胞中表现出较低的丢失率，使其成为高效的内源性条形码。此方法使得高通量单细胞混合样本的精确拆分成为可能。内源性标记不仅提升了单细胞测序数据的准确性，还克服了现有标记方法的局限性，为拆分单细胞样本提供了一种成本效益高且稳健的解决方案。细胞间线粒体转移研究揭示了其在正常生理和疾病状态中的关键作用。尽管已有研究进展，我们对多种细胞间线粒体转移途径的分子机制仍然理解有限。这些机制可能在细胞类型、组织和环境条件方面具有特异性。进一步阐明这些途径可能会革新我们对线粒体生物学的理解，并为治疗干预提供新的方向。![]()
首先，方法学上优化通量与mtDNA覆盖率之间的平衡至关重要。基于孔板的单细胞mtDNA测序提供较高的覆盖率和测序深度，但其通量较低且缺乏同时测量其他组学的能力。相反，基于液滴的技术具备高通量和低成本的优势，且易于同时捕获其他组学信息，但其通常测序深度较低。为应对这些限制，亟需开发能够结合高通量、高测序深度及兼顾mtDNA与多组学同时测序的方法。其次，单细胞水平的多组学数据获取对于理解mtDNA变异的功能后果尤为关键。此前的研究表明，线粒体功能失调显著改变了细胞代谢，进而影响核表观遗传学。例如，人类mtDNA异质性逐步增加会通过影响核组蛋白乙酰化，诱导核基因组转录重编程。此外，mtDNA拷贝数与全基因组DNA甲基化水平之间存在复杂关系。这些发现强调了需要同时读取mtDNA基因型和核表观遗传信息的技术的重要性。此外，将TGS与高通量单细胞平台整合，使得捕获单倍型和多组学数据成为可能，为理解mtDNA结构变异的功能效应和变异间的上位效应提供新见解。此外，mtDNA的组织结构是未来研究的一个重要方向。拟核（nucleoid）是一个由mtDNA、蛋白质和RNA构成的复合物，在线粒体遗传学中起着至关重要的作用。未来能够在单细胞或单线粒体水平上高通量量化拟核结构的技术，可能会为我们深入理解拟核组织如何影响mtDNA的复制和在细胞分裂过程中的分配提供新的视角，从而控制mtDNA变异的异质性频率。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.mitoco.2024.10.001Mitochondrial Communications是一本开放获取的同行评审英文期刊，期刊涵盖了线粒体在基础理论和临床疾病方面的科学和重要问题。期刊主编由南开大学生命科学学院院长陈佺教授担任，期刊荣誉主编由美国费城儿童医院Douglas Wallace教授担任。
线粒体是细胞内的能量工厂，也是解开生命过程和疾病研究的关键因素，Mitochondrial Communications作为一个集结线粒体生物学中前沿性观点的平台，致力于促进以线粒体健康为导向的跨学科研究，旨在快速发表高质量、经过严格同行评审的研究文章、综述及评论。
Mitochondrial Communications不仅关注围绕线粒体功能、结构、动力学、信号传导、基因组、突变、遗传等方面的前沿科学问题，且广泛欢迎涉及线粒体与代谢、衰老、神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、免疫系统等领域的科研成果、前沿技术和理论探讨。
被Mitochondrial Communications录入的文章都是通过严格的同行评审，并全文发表在月活用户超过1700万的ScienceDirect平台，供领域内的学者及全球读者免费阅读、下载及引用。
荣誉主编
Douglas Wallace 教授
美国费城儿童医院
