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本文亮点
主要结果
结果1：Bradyrhizobium 菌株的分离和特性。分别从Diandou No.2 和 Qiandou No.7 两个大豆品种的根瘤中分离出 Bradyrhizobium 的两株菌株，即 Bra.D 和 Bra.Q2。这些细菌的 16S 序列与 NCBI 数据库的比对结果显示，Bra.D 与 Bradyrhizobium ortawaense O099 高度相似，而 Bra.Q2 则与 Bradyrhizobium liaoningense 2281(2)相似度达 100%。此外，还从 Qiandou No.7 的根瘤中分离出一种芽孢杆菌，与 Bacillus zanthoxyli 1433 高度相似。这两种根瘤芽孢杆菌都能分泌 indole-3-acetic acid (IAA)，但没有利用柠檬酸盐、液化明胶或再固定不溶性磷酸盐的能力。不过，只有 Bra.D 的淀粉水解能力较强。两株 Bradyrhizobium 的生长曲线相似，都在接种后 3 天达到最大生长期。
Isolation and properties of strains.
结果2：Bradyrhizobium 促进大豆生长。Bra.Q2 和 Bra.D 都通过固氮作用影响大豆生长。盆栽实验结果表明，与对照相比，接种 Bra.D 或 Bra.Q2 可使大豆鲜重增加 19.4%-27.4%。同样，接种 Bra.Q2 和 Bra.D 的大豆的氮含量也分别比对照高 89.4% 和 167.5%。此外，不同菌株长出的根瘤也有区别，主要表现为 Bra.Q2 长出的根瘤比 Bra.D 长出的根瘤少但重。在田间条件下，进一步评估了 Bra.Q2 和 Bra.D 对大豆生长的影响。将处于同一生长阶段的两种菌株混合并用于浸泡大豆种子。与对照相比，在两种氮肥处理条件下，Bra.Q2 和 Bra.D 共同接种都能显著促进植物生长、植物体内氮含量和产量。尤其是在-氮肥和+氮肥处理下，接种 Bradyrhizobium 后，粒重分别增加了 13.0% 和 17.4%。此外，接种 Bradyrhizobium 后，结瘤的数量和干重也显著增加。总之，这些结果表明，Bra.Q2 和 Bra.D 能促进大豆中氮的利用，从而提高植株的生长和产量。
Two Bradyrhizobium strains promote soybean growth and nodulation.
结果3：芽孢杆菌对 Bradyrhizobium-大豆共生的逆向影响。结果表明，从 Qiandou No.7 结瘤中分离出的芽孢杆菌对 Bra.Q2 和 Bra.D 在大豆上的结瘤有负面影响。Bac.B 和 Bra.Q2 共同接种后，大豆幼叶和成熟叶片的 SPAD 值和叶绿素浓度均下降，而 Bac.B 只抑制 Bra.D 作用下大豆幼叶的 SPAD 值。与单一接种 Bra.D 或 Bra.Q2 相比，联合接种 Bac.B 可显著抑制植物生长，抑制率分别为 32.6% 和 30.1%，植物体内的氮含量分别降低了 59.7% 和 47.5%。在进一步的实验中，Bac.B 对接种 Bra.Q2 的大豆的生长抑制作用再次得到验证；然而，与未接种对照相比，单次接种 Bac.B 对大豆生长无明显影响。这些结果表明，Bac.B 对大豆生长没有影响，但与 Bac.B 联合接种会抑制 Bra.D 和 Bra.Q2 的生长促进作用。随后研究了 Bac.B 对 Bradyrhizobium 的影响。与 Bac.B 联合接种会显著抑制根瘤的发育和减少根瘤中的类菌体数量，表明根瘤中有效的 N2 固定区减少。此外，Bac.B/Bra.D 联合接种和 Bac.B/Bra.Q2 联合接种都会减少大根瘤（直径大于 2 毫米）的鲜重，增加小根瘤的鲜重。进一步表明 Bac.B 对根瘤中的 N2 固定有抑制作用。
Bac.B decreases nitrogen uptake and plant growth in the Bradyrhizobium–soybean symbiosis.
结果4：为了阐明单一接种 Bra.Q2 和 Bac.B 与 Bra.Q2 共同接种对根瘤中基因表达谱的改变，进行了转录组分析。与单一接种 Bra.Q2 相比，Bac.B 和 Bra.Q2 联合接种产生了 3340 个差异表达基因（DEGs），其中 1649 个基因上调，1691 个基因下调。此外，KEGG 通路富集分析表明，这些 DEGs 主要在苯丙酮生物合成、淀粉和蔗糖代谢、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路和多种 N 代谢通路中受到调控。Bac.B 的存在调节了 Bra.Q2 接种下的根瘤分子功能，包括氮代谢、次生代谢和激素代谢。为了证实 RNA-seq 的结果，对参与氮吸收、类黄酮代谢和 IAA 代谢的七个 DEGs 的转录本进行了 qRT-PCR 分析。与单一接种 Bra.Q2 的根瘤相比，在与 Bra.Q2 和 Bac.B 联合接种的根瘤中，GmNRT1、GmNRT2、GmAMT1、Gm7-IOMT、GmIAA1 和 GmIAA2 的表达水平显著降低，而 GmAMT2 的转录显著增强。这些结果与 RNA-seq 分析的结果一致。
Alteration of transcriptome profile in nodules under coinoculation of Bac.B and Bra.Q2.
结果5：Bac.B 与稻瘟病菌之间的相互作用。由于一组 DEGs 与类黄酮的合成有关，因此认为 Bac.B 可能会影响类黄酮的合成，并介导大豆-稻瘟病菌的共生。随后，研究了黄酮类化合物是否能介导 Bac.B 与 Bradyrhizobium 的相互作用。结果发现，施用柚皮苷、槲皮素和大豆苷能促进 Bra.Q2 的生长，而只有大豆苷能促进 Bra.D 的生长。有趣的是，Bac.B 的分泌物削弱了施用柚皮苷对 Bra.Q2 生长的促进作用，但不影响施用槲皮素或大豆苷的促进作用。研究表明，Bac.B 可能会通过破坏柚皮素介导的生物反应，对 Bra.Q2 与大豆的共生产生负面影响。
Interactions between Bac.B and Bradyrhizobium.
结果6：Bac.B 调节根瘤中的细菌组成。通过 16S rDNA 测序分析了接种 Bra.Q2 和 Bac.B 的根瘤中的细菌群落。Bra.Q2/Bac.B 的共同应用调节了根瘤中特定的细菌组成。然后，研究了改变的细菌生物标志物与植物氮相关表型之间的关系。热图分析显示，Bra.Q2/Bac.B 共同接种产生的细菌相对丰度与大豆植株和根瘤中的生物量和氮含量之间存在明显的负相关。相反，Bra.Q2/Bac.B 共同接种排出的细菌与这些表型呈显著正相关，表明 Bac.B 和 Bra.Q2 共同接种诱导的微生物变异可能与植物氮吸收和生长的减少有关。
Coinoculation of Bac.B and Bra.Q2 influences bacterial community in nodules.
主要结论
本研究中豆科植物-根瘤-芽孢杆菌的相互作用促进了它们之间的相互交流，可以表示为三方关系。研究结果表明，在芽孢杆菌 Bacillus 的参与下，Bradyrhizobium 与大豆的共生关系中出现了显著的负效应。本研究发现了芽孢杆菌抑制生物膜形成和柚皮苷调控 Bra.Q2 生长的根瘤内生态相互作用网络的新见解。此外，Bac.B 和 Bra.Q2 的共同接种调节了根瘤内的氮吸收、类黄酮和激素代谢，还影响了根瘤内与植物氮效率相关的细菌组成。研究结果为植物与微生物之间的生态互动提供了新的见解，对提高可持续农业中的大豆产量具有潜在影响。
Schematic summary of the tripartite relationship between soybean nodule, Bradyrhizobium and Bacillus. Coinoculation of Bac.B and Bra.Q2 results in small and hollow nodules compared to inoculation with Bra.Q2 alone. Bac.B directly regulates biofilm formation and naringenin-mediated growth of Bra.Q2, which affects symbiotic N2 fixation. In addition, Bac.B affects molecular processes related to nitrogen (N) metabolism, hormone metabolism and secondary metabolism in the nodules, thereby influencing the Bradyrhizobium–soybean symbiosis and composition of bacterial communities. Further research is needed to understand the resistance mechanisms of soybean and Bradyrhizobium against Bac.B invasion. The results from present manuscript are indicated by solid arrows, and the hypotheses are indicated by dotted arrows.
