背景
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又称内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，可作用于膜受体激活多种细胞（巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等）信号转导系统，促进促炎细胞因子和其他炎性介质的合成及释放，引发炎症反应。客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。
材料与方法
取干燥羊栖菜粉末，加入体积分数60%乙醇溶液，使用 SCIENTZ-IID 超声辅助浸提（料液比1∶20（m/V）、50 ℃、60min），抽滤后真空减压蒸馏去除乙醇，获羊栖菜粗多酚溶液，依次采用等体积石油醚、乙酸乙酯分级萃取，真空减压蒸馏后冻干（使用 SCIENTZ-12N 过夜冻干），获得HFPs粉末。测得HFPs粉末总酚含量为23.67±0.24 mg/g。利用无菌水配制成多酚母液，再以细胞培养液稀释至不同浓度，用于后续实验。
使用完全培养基（含10%（体积分数，下同）胎牛血清和1%青链霉素双抗DMEM培养基）培养RAW264.7细胞，37 ℃、5% CO2培养，细胞融合度约80%时进行传代。然后分成3组进行培养：
①阴性对照组，仅加入含10%胎牛血清的DMEM培养基；
②LPS阳性对照组，加入含LPS（1μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24 h；
③HFPs+LPS组，经含不同质量浓度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，以含LPS（1μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24h。
1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，每孔加入500μL TRIzol试剂，使用 SCIENTZ-IID 加速破碎细胞协助提取总RNA，超声参数为：100W，1s开1 s关，共1min，并将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green嵌合荧光法与引物进行实时荧光定量PCR。测定目的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和内参基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，加入200μL RIPA细胞裂解液，使用 SCIENTZ-IID 加速破碎细胞协助提取蛋白质，超声参数为：100W，1s 开1s关，共1min，离心（12000r/min、4 ℃）10min取上清液。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，用蛋白上样缓冲液调整蛋白质量浓度为2mg/mL，95 ℃加热10min使蛋白变性然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；湿转到聚偏二氟乙烯膜；5%（质量分数）脱脂奶粉（TBST溶液配制）封闭1h；一抗4 ℃孵育12h；二抗室温孵育2h；加入ECL试剂进行显色反应，测定蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相应蛋白磷酸化水平。
结果与分析
采用实时荧光定量PCR测定HFPs对LPS诱导的巨噬细胞中重要促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因相对表达量，以及炎症相关酶COX-2基因相对表达量的影响。如图1所示，LPS刺激不同时间后，所有炎症介质的mRNA表达水平均显著提高（P＜0.05）。HFPs对促炎细胞因子的抑制作用与其剂量、LPS诱导时间及细胞因子种类相关。与LPS组相比，静息状态细胞经HFPs处理再经LPS诱导12、24h后，IL-1β和IL-6的基因相对表达量显著下降；HFPs显著抑制LPS诱导3h后TNF-α基因的相对表达，而在LPS诱导6～24h的抑制作用总体不明显。在LPS诱导24h，较低剂量HFPs（30、60μg/mL）预处理对COX-2基因表达具有显著抑制作用，但提高剂量后该抑制效果消失，甚至出现反向促进作用，120μg/mL HFPs预处理促使COX-2相对表达量较LPS组显著上升（P＜0.05）。
1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，加入200μL RIPA细胞裂解液，使用 SCIENTZ-IID 加速破碎细胞协助提取蛋白质，超声参数为：100W，1s 开1s关，共1min，离心（12000r/min、4 ℃）10min取上清液。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，用蛋白上样缓冲液调整蛋白质量浓度为2mg/mL，95 ℃加热10min使蛋白变性然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；湿转到聚偏二氟乙烯膜；5%（质量分数）脱脂奶粉（TBST溶液配制）封闭1h；一抗4 ℃孵育12h；二抗室温孵育2h；加入ECL试剂进行显色反应，测定蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相应蛋白磷酸化水平。
总结
客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。超声波细胞粉碎机在整个实验中起到作用如下：
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