Nat Commun：邱伟/秦峰/刘晓东揭示多发性硬化髓鞘再生障碍新机制

多发性硬化（MS）是西方人群最为常见的神经系统疾病之一（>1/10000患病率），而东方人群相对少见（<1/10万患病率），2018年中国官方将其列为罕见病。作为一种经典的免疫介导的脱髓鞘疾病，MS病理机制为有髓神经纤维的髓鞘遭受了持久且严重的免疫攻击。正常情况下，机体具备自我修复功能，能够促使少突胶质前体细胞（OPC）分化成少突胶质细胞并生产髓鞘从而修复损伤；然而在慢性病程中，髓鞘再生过程常受阻碍，导致MS患者病情恶化进展。

MS目前无治愈方法，治疗主要集中在免疫调节领域，但仍不能有效阻断疾病进展。近年，中枢神经系统内不同胶质细胞相互作用成为研究热点，它也可能是影响MS患者OPC分化的关键因素之一。因此，该研究探讨MS患者胶质细胞间相互作用的机制，从而开发新的MS治疗靶点。

1、临床数据显示CLU在MS患者及动物模型脑组织中表达

MS患者标本结合已公开发表的测序数据显示，星形胶质细胞（AST）在活跃的病灶区域呈现显著的Clusterin（CLU）高表达。免疫荧光揭示，CLU主要与GFAP⁺AST细胞共定位，且在活动性病灶区域。另外，在MS的实验模型EAE中，小胶质细胞（IBA1⁺）、少突胶质细胞前体（OPC，PDGFRa⁺）、成熟少突胶质细胞（CC1⁺）、神经元（NeuN⁺）以及血管内皮细胞（CD31⁺）中均未检测到CLU表达信号。同时，在EAE模型和LPC诱导的脱髓鞘模型的病灶中，也观察到AST细胞CLU表达上调。最后，EAE中CLU表达水平与EAE残疾评分存在显著相关。然而，在铜腙诱导的非炎症脱髓鞘模型中，并未出现CLU表达上调（图1、图2）。证明，CLU仅在“炎性”脱髓鞘环境下，且仅在AST细胞的特异性表达。

△图1  CLU在MS和小鼠EAE模型中的星形胶质细胞中表达水平升高

△图2  单细胞测序分析提示CLU在多发性硬化患者病灶中AST细胞中高表达

2、CLU可抑制星形胶质细胞吞噬髓鞘碎片功能

通过RNAseq，研究人员探究了CLU对AST细胞增殖和功能影响。利用体外EDU增殖实验，研究人员成功验证了CLU对AST细胞增殖的促进作用。体内缓释泵实验进一步证实，CLU在小鼠中枢神经系统能显著增强GFAP⁺ALDH1L1⁺AST细胞的增殖能力。另一方面，髓鞘吞噬实验证明，CLU可抑制AST细胞的髓鞘吞噬功能。然而，对于另一类髓鞘碎片清除细胞——小胶质细胞，CLU对其吞噬功能无明显影响（图3）。因此，CLU在神经系统中对AST起重要作用。

△图3  CLU对星形胶质细胞和小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的影响

3、CLU可损伤少突胶质细胞及其前体OPC细胞并导致髓鞘缺失

通过RNAseq，研究人员对CLU刺激下少突胶质前体细胞（OPC）进行测序分析。结果显示，CLU在短时间内（3h）即可显著下调与OPC分化及髓鞘形成紧密相关的基因表达。GSEA中的GO注释表明CLU对OPC的毒性作用，在“response to toxic substance”和“mitochondrial outer membrane permeabilization involved in programmed cell death”等过程中富集。在长时间（24h）刺激后，研究人员发现CLU暴露与Pi3k-Akt信号通路抑制紧密相关。因此，CLU对OPC有作用，不仅导致其增殖和分化过程出现障碍，还能对其细胞功能造成损害。研究人员进一步行体外刺激实验，证实CLU会导致OPC的分化与成熟异常，同时观察到其增殖能力下降和凋亡率上升。

在器官型脑片实验中，研究人员也观察到相同结果，证实CLU的负面效应。基于NG2-CreERT2:: taumGFP报告小鼠的实验模型，研究人员观察到外源性CLU的持续泵入会导致GFP⁺新生髓鞘减少，以及髓鞘厚度的显著降低。此外，当研究人员在AST细胞中特异性过表达CLU（利用Cre-DIO系统）时，也观察到相同结果，包括NG2⁺ OPC和CC1⁺少突胶质细胞数量的减少，以及CC3⁺凋亡细胞比例增加。电镜也显示局部髓鞘厚度变化。综上所述，在病理状态下，AST细胞所分泌的CLU会对少突胶质细胞及其前体细胞造成损伤。然而，CLU对神经轴索并未产生显著影响（图4-7）。

△图4  RNAseq显示CLU对OPC转录水平的影响

△图5  CLU在体外对少突胶质细胞及其前体细胞的影响

△图6  不同时间点CLU在体外对于少突胶质细胞及其前体细胞的影响

△图7  NG2-CreERT2:: taumGFP报告小鼠及CLU特异性过表达系统(Cre-DIO)提示星形胶质细胞所分泌的CLU对少突胶质细胞及其前体细胞造成损伤

4、CLU对少突胶质细胞及其前体OPC细胞的损伤由VLDLR介导

通过对不同年龄阶段小鼠大脑的研究，研究人员发现少突胶质细胞及其前体OPC细胞持续稳定地表达VLDLR，而AST细胞则主要表达ApoER2受体。此外，在EAE和LPC脱髓鞘模型中，这些受体依然存在持续表达。因此，VLDLR在CLU诱导的OPC损伤中扮演核心角色。研究人员进一步采用NG2启动子慢病毒介导的特异性敲低技术，针对NG2⁺ OPC细胞中的VLDLR进行敲低操作。结果表明，VLDLR敲低后，OPC中的EDU⁺细胞比例显著增加，而CC3⁺细胞比例显著降低。因此，VLDLR的减少可以有效缓解CLU对OPC的损伤作用（图8-9）。

△图8  少突胶质细胞及其前体细胞在不同年龄段与不同模型中的VLDLR表达情况

△图9  利用慢病毒特异性敲低NG2⁺ OPC细胞VLDLR后可减轻CLU对OPC细胞的损伤

5、Pi3k-Akt通路是CLU诱导OPC损伤的重要机制

在体外实验中，研究人员通过测序揭示了CLU对Pi3k-Akt通路的抑制作用。随后，研究人员采用缓释泵系统为外源性CLU暴露小鼠分别注射了Akt激动剂SC79与拮抗剂MK2206，并观察到了显著的生物学效应。具体而言，SC79能够部分逆转由CLU暴露引起的NG2⁺/CC1⁺细胞数量减少，同时降低了CC3⁺细胞比例；MK2206则加剧CLU对NG2⁺ OPC细胞及CC1⁺少突胶质细胞的损害。因此，CLU通过抑制Pi3k-Akt通路，导致了少突胶质细胞及OPC细胞的损伤（图10）。

△图10  CLU通过抑制Pi3k-Akt通路导致少突胶质细胞及其前体细胞损伤

6、CLU敲低与敲除可提高小鼠脱髓鞘病灶的髓鞘修复

利用携带shCLU的AAV，研究人员成功地敲低了小鼠胼胝体区的CLU表达，另外借助GfaABC1D启动子的AAV-Cre-EGFP特异性地敲除了CLU^fl/fl小鼠胼胝体区AST细胞的CLU。随后，对这些小鼠行LPC脱髓鞘模型，结果显示CLU敲低与敲除显著提高了LPC脱髓鞘病灶区域内OPC和OL细胞数量和髓鞘厚度。结果提示局部CLU表达的敲除对于LPC脱髓鞘病灶的髓鞘再生具有显著的促进作用。研究人员进一步构建了ALDH1L1-CreERT::CLU^fl/fl条件敲除小鼠，并对其进行EAE造模。结果显示，条件敲除小鼠相较于对照组表现出较低的疾病发病水平，且其脊髓病灶中的OPC的凋亡现象有所缓解。此外，敲除小鼠病灶中IBA1⁺小胶质细胞/巨噬细胞的数量显著减少，提示AST细胞上CLU的敲除可能具有髓鞘保护效应（图11-14）。

△图11  CLU敲低可增强LPC导致的胼胝体脱髓鞘病灶的髓鞘再生

△图12  敲低CLU可促进LPC脱髓鞘病灶的髓鞘修复

△图13  敲除星形胶质细胞CLU可减轻EAE发病程度及病灶内少突胶质前体细胞的损伤

△图14  敲除星形胶质细胞的CLU可促进LPC脱髓鞘病灶的髓鞘修复，减轻EAE脱髓鞘病灶中IBA1⁺细胞数量

△图15  MS/EAE中星胶“发炎”，抑制髓鞘再生