项目文章：LPC在急性肝损伤疾病中的促炎反应研究

文摘其他 2023-12-21 18:00 上海

肝脏具有巨大的再生潜力。慢性或严重的肝损伤，包括肝纤维化和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），伴随着胆管的病理增殖或增生，被称为胆管反应。这些胆管反应细胞表达中间肝胆marker基因，并从门静脉周围区域扩展到周围实质组织，这代表了变性肝前体细胞（LPCs）的活化。最近，人们开始关注在肝损伤 (尤其是晚期肝病) 中诱导的LPCS在胆管反应中的的确切来源和作用。

文章题目：CD24⁺LCN2⁺liver progenitor cells in ductular reaction contributed to macrophage inflammatory responses in chronic liver injury

本次公众号，纽科生物解读2023年10月发表Cell&Bioscience杂志的项目文章，介绍有关在肝损伤背景下LPC在胆管反应中的相关研究，该研究中转录组测序和单细胞数据生信分析由纽科生物提供。

CD24⁺CK19⁺/CD24⁺SOX9⁺肝脏驻留细胞（resident liver cells）在慢性肝损伤后的胆管反应（ductular reaction, DR）中被激活和扩增。然而，这些细胞在肝损伤中的来源和功能仍存在争议。目前的研究将基因谱系追踪与体外小分子重编程相结合，确定了来自肝实质（parenchymal）组织和非实质（non-parenchymal）组织的肝前体细胞（LPCs）。本项研究中发现，CD24⁺LCN2⁺LPCs构成了不断扩大的胆管反应，并在慢性肝损伤中促成了巨噬细胞介导的炎症。该研究突显了不同来源的LPCs的作用，并揭示了以LPCs为靶点治疗慢性肝病的可能性。

图1：CD24⁺LCN2⁺LPCs作用

位于成人肝脏赫林管的细胞被认为是驻留LPCs，它们表达胎儿肝细胞和胆道上皮细胞（BECs）的marker基因，在慢性损伤过程中可能生成肝细胞和胆管细胞。最近的研究表明，肝细胞和胆管上皮细胞都有可能在损伤后分裂和相互转化。硫代乙酰胺诱导的肝损伤或遗传性肝细胞增殖受损。

研究发现，体外培养的Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs移植会通过LCN2引起巨噬细胞的强烈反应，从而加剧肝功能异常。这些发现揭示了肝细胞浆毒性，有助于推进基于LPC的慢性肝病治疗。

损伤肝脏组织中的LPC的溯源与体外培养

从肝实质细胞和非实质细胞中生成CD24⁺肝前体细胞并确定其特征

CD24⁺是上皮干细胞前体细胞的重要标志,通过控制增殖和分化之间的平衡来调节同种细胞的更新。在肝纤维化的临床样本中，CD24⁺CK19⁺/CD24⁺SOX9⁺ 胆管反应细胞大量存在于胆管反应区域，表明胆管反应细胞的活动和扩张。同样在CCl₄诱导的肝损伤后，对NPCs的单细胞转录组测序数据分析发现了表达SOX9/CK19/HNF1B/FOXA2 /ALB/ASS1的可选性CD24⁺LPCs细胞亚群。这些发现证实了推测的LPCs存在于胆管反应中。

所有3种类型的 LPCs在第5周期均生长为连续的单层细胞。EdU结合测定和 Ki67染色表明，在TEM中培养的所有LPCs都有相似的分裂率（division rate）。免疫荧光染色和FACS分析表明，所有三种LPCs的SOX9、CD24 和CD44 表达水平相似，但CD34、CD45和CD90 表达水平不同。进行了基因表达分析（纽科生物提供生物信息学分析），比较了LPCs与Kupffer细胞（KCs）、肝星状细胞（HSCs）、肝窦状内皮细胞（LSECs）、肝细胞（HCs）和胆道上皮细胞（BECs）的基因表达模式，以排除这些细胞可能造成的污染（图2）

图2. 基因表达分析

它值得注意的是，所有三种类型的LPC都表达了许多干/前体细胞marker基因，如CD44、Hnf1b、Foxa2和Sox9。总之，这三种来自不同肝脏来源的培养LPC是在TEM中培养生成的。

来自实质细胞的LPC与原有LPC的功能差异

RNA-seq结果表明，HepLPCs和BecLPCs继续表达肝胆系基因。相反，以分离肝细胞和BECs为对照，从驻留LPCs衍生的LPCs既不表达包括 Cyp1a2 、Hnf1a在内的肝细胞系marker基因，也不表达胆管相关基因 Epcam（图3）。在这些marker基因物中，HNF1α和EpCAM 在三种 LPCs 中的表达已通过FACS 分析得到验证。此外,GESA 分析表明，Wnt 通路的基因在 HepLPCs中富集，而Notch 通路的基因在BecLPCs中富集，这证实了它们分别独立来源于肝系和胆系。

图3. 热图显示了在三种培养的LPCs、HC和BEC中已知的肝细胞和胆道细胞基因表达情况

图4. 通过流式细胞仪评估在三种培养的LPCs中HNF1A和EpCAM阳性细胞的定量

体外培养的Cd24a⁺Lcn2⁺LPC表达谱从驻留LPCs中提取的LPCs与在胆管反应中发现的体内LPCs相似

通过转录组测序与生物信息学分析找到不同来源的LPC在基因表达、功能富集、相互作用方面的差异性（纽科生物提供)。

1) 转录组测序生成了三种培养LPC的转录组图谱，并进行了差异基因表达分析，以确定特异性marker基因。共发现 533个基因具有BecLPC特异性，657个基因具有HepLPC特异性，266个基因具有驻留LPC特异性（图5）。

2) GO和KEGG分析揭示了一些功能差异。BecLPCs差异表达的基因主要集中在Wnt信号转导的负调控方面，而HepLPCs差异表达的基因主要集中在P450代谢和Notch信号转导的负调控方面（图6）。在每组特定基因中，发现Epcam、Krt17、Lgr6、Ltbp2和Onecut2在BecLPCs中上调，而Rbp4、Hnf1a、Hnf4a、Lgals2和Stra6在HepLPCs中上调。上皮细胞增殖在所有三种LPCs中都得到了富集，但值得注意的是，先天免疫和炎症通路、HIF-1以及氧化应激和代谢过程在 HepLPCs 中也得到了富集。

3）GSEA验证了这些LPCs中 HIF-1、IL17、JAK/STAT 和 NF-kB通路的显著富集。利用STRING数据库，确定LCN2在这些体外培养的驻留LPCs特异基因集中高度表达，并与其他免疫和炎症相关基因深度相关，尤其是Parp14、Oas2、Nrp2和Nlrc5（图7）。

图5. 差异基因表达分析

图6. GO 和 KEGG 分析

图7. 韦恩图

根据这些用于区分LPC来源的潜在marker基因组，比较了接受DDC饮食的动物肝细胞衍生增殖导管（hepPDs）与培养的LPCs的基因表达谱（图8）。根据特定marker基因物的表达生成的热图显示，DDC-hepPDs中这些marker基因物的表达水平与培养的 LPCs 相当。此外，还观察到 DDC- hepPDs与HepLPCs而不是Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs或BecLPCs的聚类更为接近，这表明体外培养的 LPCs 与体内 LPCs 的状态相关。

根据这种相关性，还比较了体内CCl₄处理后分离的Cd24a⁺LPCs（CCl₄^-LPC）与体外培养的负Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs的表达谱（图8）。同样，热图显示 CCl₄^-LPC与Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs的相互关系更为密切。对CCl₄处理组和正常组特异性marker基因物的定量PCR分析进一步证实了这些结果。这些发现表明，肝胆管反应中的内源性Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs可能来源于原有的驻留LPCs。

图8. 表达谱

单细胞RNA测序和驻留LPCs衍生的Cd24a⁺Lcn2⁺LPCs空间定位

胆管反应的程度与NASH等一系列致病原因造成的疾病严重程度呈正相关。饲喂富含脂肪、果糖和胆固醇（FFC）饮食导致NASH 的小鼠肝脏也会差异表达一些Cd24a⁺Lcn2⁺LPC特异性基因（图 9）。

值得注意的是，在CCl₄诱导的肝纤维化模型和胆碱缺乏性 L-Amino 酸定义的高脂饮（CDAHFD）诱导的NASH模型中，LCN2也被证明在胆管反应细胞中上调。此外，这些肝损伤更严重的模型通过qPCR显示出更高的 LCN2和CD24表达，尤其是在NASH模型中。

图9. NASH 的小鼠肝脏也会差异表达一些Cd24a⁺Lcn2⁺LPC特异性基因

CD24⁺LCN2⁺LPCs可在体外和体内引起强大的巨噬细胞反应

与CCl₄处理的小鼠相比，CDAHFD喂养的小鼠中有更多的LCN2阳性肝细胞。在NASH模型中肝细胞衍生的LCN2可能会妨碍研究LPCs衍生的LCN2对抗肝纤维化的作用。因此，本项研究中将GFP/荧光素酶marker基因的CD24⁺LCN2⁺LPCs（2×10⁶）移植到CCl₄处理的小鼠体内（图10a），并将HepLPCs视为对照组。

移植24小时后，通过活体成像可以发现CD24⁺LCN2⁺LPCs和HepLPCs 。虽然HepLPCs 移植减轻了肝损伤，但与对照组小鼠相比，CD24⁺LCN2⁺LPCs移植在第40天增强了H&E、天狼星红、CK19 和α-SMA染色下的胆管反应和肝纤维化，并提高了ALT和AST 的血清水平（图10b-d）。这些结果表明，CD24⁺LCN2⁺LPCs会加剧而非缓解肝损伤。

图10.CD24⁺LCN2⁺LPCs的移植通过浸润巨噬细胞加重了慢性纤维化和炎症

LCN2可招募炎症细胞并引发炎症反应。同样，移植高表达Lcn2的 CD24⁺LCN2⁺LPCs会增强F4/80⁺巨噬细胞和中性粒细胞的组织浸润，MPO 染色显示了这一点（图10b）。图10c中，利用sc-RNA seq的CellChat工具包研究了Cd24a⁺Lcn2⁺细胞与其他NPC之间的细胞间作用网络，结果显示 Cd24a⁺Lcn2⁺细胞与M1巨噬细胞的相互作用最强。（图10e，f）。体外透孔试验表明，CD24 ⁺ LCN2 ⁺LPCs对骨髓源性巨噬细胞（图10g，h)的化疗作用增强。此外，用CD24⁺LCN2⁺LPC条件培养基培养的BMDMs表达了更高水平的M1 marker基因，包括IL-1b、IL-6 和诱导型一氧化氮合酶（图10i、j），而用HepLPC条件培养基培养的BMDMs则表达了更高水平的M2 marker基因ARG1。

在CD24⁺LCN2⁺LPCs中沉默Lcn2基因可消除对巨噬细胞的趋化性旁分泌作用，并阻止M1 marker基因基因的上调（图10k、l）。总之,补充CD24⁺LCN2⁺LPCs可增强巨噬细胞反应，这可能会加剧慢性肝损伤。

单细胞图谱揭示了人类肝硬化肝脏中的CD24⁺LCN2⁺LPC-巨噬细胞-细胞通讯网络

肝硬化肝病中的NPC类型数据集被划分成群，并使用已知系谱marker基因的特征进行注释。CD24、LCN2和SOX9高表达的细胞亚群与上皮细胞相关（图11a），与巨噬细胞的相互作用尤为明显（图11b）。纽科生物提供单细胞数据分析，用于揭示LPC-巨噬细胞细胞通讯网络。无监督UMAP 分析确定了12个巨噬细胞亚簇（sc-0-11），其sc-10/6/2/5/7在肝硬化肝脏中最为富集（图11c）。巨噬细胞转录组分析显示，与其他亚簇相比，sc-6的促炎症基因和促炎症表面标志物的上调率最高（图11d、e）。对NF-kB靶基因的定量分析显示，在所有12个亚群中，sc-6/1/5/7的得分较高（图11f、g）。sc-6和sc-7亚群具有增强的促炎表型，而sc-6/1/5/7亚群则没有。与CD24⁺LCN2⁺LPCs的相互作用最强（图 11h）。最后，随着肝纤维化发展为肝硬化，胆管反应也会加重，免疫荧光染色显示肝组织中被更多巨噬细胞包围的 LCN2⁺LPCs数量不断增加（图12i）。因此，人类肝脏NPCs单细胞图谱和免疫荧光染色证实，CD24⁺LCN2⁺ LPCs参与了胆管反应，通过巨噬细胞招募加剧了炎症和纤维化。

图11 dPspCas13b-YTHDC1位点特异性招募KDM3B进行H3K9me2去甲基化

上述研究证明：CD24⁺LCN2⁺LPCs在慢性肝病期间被激活，促进了巨噬细胞的浸润和极化，并加剧了肝脏炎症和纤维化。这些发现揭示了不同来源的LPCs的不同作用，可能有助于确定治疗慢性肝病的LPCs。

关于我们

纽科生物提供专业的生物信息学数据分析和高通量测序服务。目前，公司已经和四川大学、复旦大学、上海交通大学、中山医院、华中科技大学等多所医院、高校的研究团队建立了长期良好的合作关系，提供高品质的数据分析和测序服务，帮助客户在European Heart Journal、Circulation Research、Nature Communications等多个著名杂志期刊上发表高水平科研文章，欢迎各位老师前来咨询。

纽科生物

提供优质的高通量测序和生物信息学个性化数据分析服务，http://www.RNAstar.com