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成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 及其 CRISPR 相关 (Cas) 核酸酶赋予细菌和古细菌对外来移动遗传元件的适应性免疫。这些 CRISPR/Cas 系统依赖于crRNA、PAM位点、侧翼序列（PFS）。然后，靶标识别会引发无数的免疫活动，从切割靶标核酸位点到通过广泛的 RNA 或 DNA 降解诱导细胞休眠或细胞死亡。Cas核酸酶在 RNA 引导的核酸靶向的能力使其用于基因组编辑和诊断。有趣的是，Cas12a 作为Cas9 的替代核酸酶，因为它依赖于富含 T 的 PAM，在其DNA 靶标中产生交错的双链断裂，并且使用短 crRNA，无需tracrRNA。此外，Cas12a 核酸酶可以自行处理 crRNA，从而实现多重分析并减少脱靶率。最后，激活的 Cas12a 会同时切割单链 DNA (ssDNA)，该单链 DNA 已用于信号放大，作为基于 CRISPR 的分子诊断的一部分。尽管具有潜力，Cas12a 的效率也低于其他 Cas 核酸酶。为了弥补这一差距，依赖于天然核酸酶的一些突变，例如AsCas12a、LbCas12a和FnCas12a 扩大了PAM识别位点。然而，这些Cas12a 仍然不能满足使用的需求。
2024年10月31日，Nature Biotechnology 在线发表了一篇题为“A resurrected ancestor of Cas12a expands target access and substrate recognition for nucleic acid editing and detection”的研究论文。作者利用ASR技术重建ReChb，ReChb可以实现更多PAM 位点的选择，同时可以靶向并切割 RNA、ssDNA 和 dsDNA，在基因治疗，分子诊断等具有很高的应用潜力。![]()
作者首先采用了一种基于祖先序列重建（ASR）的方法。使用 ASR，作者重建了自然界中不具有活性 Cas9 核酸酶。这些蛋白质源自梭状芽胞杆菌和芽孢杆菌的 II-A 型 Cas9同源物，作者追溯了 Cas9 的进化直至脓性链球菌Cas9表现出 PAM 灵活的靶标识别、gRNA 和底物混杂甚至附带裂解。尽管古老的 Cas9 直向同源物失去了切割双链 DNA (dsDNA) 的能力，并且作为双切口酶表现出有限的基因组编辑活性，但直向同源物表明祖先重建可以解锁其他 Cas 核酸酶功能的扩展特性。![]()
在本研究中，作者应用 ASR 设计了一种功能齐全的Cas 核酸酶，该酶源自水细菌门 Cas12a 的直系同源物。由此产生的Cas12a（ReChb）在人类细胞中产生了跨 3个细胞系、7个基因和 16个靶位点的 PAM 灵活编辑，其性能优于天然和工程化的 enAsCas12a，并且可以靶向并切割 RNA、ssDNA 和 dsDNA。ReChb 扩展了 Cas12a 核酸酶的应用空间，为基因治疗到分子诊断等多种基于 CRISPR 的生物技术应用提供了独特且多功能的工具。![]()
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02461-3
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