来自美国加州大学的研究团队利用Standard BioTools公司的质谱流式技术（CyTOF）开发了一种在适应性免疫反应过程中监测 TCR 广泛变化的同时进行 T 细胞表型分析的方法， CyTOF可在单细胞水平对数百万个细胞中超过50多种标志物进行定量分析，使作者能够利用42-marker CyTOF panel同时定量T细胞分化和功能的标记物，以及Vα和Vβ链蛋白，以监测TCR的变化。为了证明方法的实用性，作者评估特异性 Vβ 和 Vα 链的 T 细胞在不同疾病模型中的功能、分化状态和增殖情况。
首先作者用 CyTOF 追踪 T 细胞对李斯特菌的反应。通过减毒双缺李斯特菌（LADD)感染小鼠，与PBS注射小鼠相比，这种小鼠要么表达常见模型抗原卵清蛋白（LADD- OVA），要么不表达（LADD）。LADD感染5天后，观察到脾脏中CD8+ T细胞的反应（图1a）。基于活化和分化蛋白标志物对CD8+ T细胞聚类和降维分析，显示LADD感染小鼠具有独特的效应T （Teff）细胞和效应记忆T （TEM）细胞（图1b）。作者进一步通过T-bet的表达来定义Teff细胞亚群（图1c），Teff_1亚群表达高水平的Ki-67和PD-1。该亚群还表达ICOS和CD25（图1c，d），表明它由早期活化的CD8+ T （Tea）细胞组成，这些细胞被报道具有独特的代谢状态。鉴于CD8+ Teff_1 亚群的抗原经历标记物富集程度最高，作者利用 Ki-67 和 PD-1 表达来寻找 LADD 感染小鼠和 LADD-OVA 感染小鼠的 TCR Vβ 和 Vα 链在增殖亚群中的富集情况（图 1e）。作者发现Vβ5.1/2+ 和 Vβ12+ T 细胞在两种感染小鼠中均增殖；Vβ14+ T 细胞在LADD-OVA感染 小鼠中选择性增殖（图 1e-h）；Vβ14+Vα2+ CD8+ T 细胞仅在LADD-OVA 感染小鼠中扩增（图 1e，i）。这些结果表明，在对 LADD 的免疫反应过程中，T 细胞使用的 TCR Vβ 和 Vα 链频率的变化可以通过CyTOF 方法检测和量化。
图1. 用 CyTOF 追踪 T 细胞对李斯特菌的反应。a, 李斯特菌感染小鼠，取脾脏用于CyTOF分析 。b, UMAP可视化CD8+T细胞。c, CD8+T细胞聚类结果通过热图展示。e, 不同处理组中TCR Vβ 和 Vα 在PD-1+Ki-67+和PD-1-Ki-67-CD8+ T细胞中的频率。f – i, LADD或LADD- OVA感染小鼠中2 中细胞类型表达TCR情况。
作者使用肽再刺激和MHC四聚体染色检测验证了量化表达 Vβ 链的 CD8+ 和 CD4+ T 细胞的特异性扩增足以捕获 LADD 的抗原特异性反应，证明了CyTOF可无需事先了解相关抗原，并能够在单细胞水平上识别抗原反应性 T 细胞。作者将 CyTOF 方法与TCR-seq和单细胞转录方法进行比较，CyTOF 方法和测序方法对 TCR Vβ 链和 Vα 链的使用产生了相似的结果，支持了CyTOF 方法在确定和描述感染过程中 TCR 重排变化的可行性和可重复性。
接下来，作者证明了CyTOF方法在呼吸道感染的自然模型中追踪 T 细胞的扩增的可行性。使用 PR8 株流感病毒经鼻给药，追踪肺、肺引流纵隔淋巴结（medLNs）、非引流腹股沟淋巴结和脾脏中 T 细胞中 TCR Vβ 和 Vα 链使用的扩增情况（图 2a）。UMAP降维分析显示，发现流感感染小鼠的肺部 CD8+ T 细胞出现了 Teff 和 TEM 亚群（图 2b）。作者再次利用 Ki-67 和 PD-1 表达来识别与流感特异性 CD8+ T 细胞相关的 TCR Vβ 和 Vα 链（图 2d）。并在流感感染的肺部发现了表达 Vβ8.3、Vβ7 和 Vβ6 TCR 链的 CD8+ T 细胞扩增（图 2e-g），它们在 Teff_1 和 Tem_1 亚群中富集（图 2h-j）。
图2. 追踪流感抗原特异性CD8+ T细胞的扩增和识别。
a,小鼠鼻内感染流感病毒，并分析其指示组织的T细胞反应。b, UMAP可视化CD8+T细胞。c, CD8+T细胞聚类结果通过热图展示。d. UMAP可视化流感感染小鼠中表达Ki-67和PD-1的CD8+ T细胞。e – g, Vβ8.3 (e), Vβ7 (f)和Vβ6 (g)在流感感染小鼠组织中的非增殖（PD-1-Ki-67-）和增殖（PD-1+Ki-67+）细胞中的表达。h-j, UMAP可视化表达Vβ8.3的CD8+ T细胞。
作者进一步研究了小鼠的预防性疫苗接种改变了应答T细胞的分化状态。给小鼠肌内注射（i.m. ）活流感病毒（PR8）疫苗，1个月后再次进行呼吸道流感病毒感染（图3a）。聚类分析未感染、i.m.接种疫苗、原发性流感感染和i.m. 接种疫苗后接受流感感染小鼠的T细胞。接种疫苗的小鼠与未接种疫苗的小鼠肺部 CD8+ T 细胞的组成没有明显差异（图 3b）。接种过疫苗的流感小鼠中，出现了一个显著的记忆亚群，该亚群通过 CD69 和 CD39 的表达加以区分（图 3b,c）。用 PD-1 和 Ki-67 作为所有 CD8+ T 细胞的活化标记，观察到接种疫苗后小鼠体内 Vβ8.3+ CD8+ T 细胞大量扩增（图 3d，e）。与此相反，在接种疫苗后受到感染的小鼠中，没有看到 Vβ6+ 或 Vβ7+ CD8+ T 细胞的扩增，与原发性流感感染时的情况一样（图 2f,g 和 3e,f）。有趣的是，在原发感染期间，Vβ8.3+ CD8+ T细胞富集于Teff集群，但在接种疫苗的小鼠中，它们反而富集于TRM集群（图3f）。这些结果表明接种疫苗后 T 细胞的克隆优势和分化模式发生了变化。
图3. Vβ8.3+CD8+ T细胞在流感免疫应答中具有不同的表型和频率。a. 用于分析的组别处理。b, UMAP可视化CD8+T细胞。c, CD8+T细胞聚类结果通过热图展示。d. UMAP可视化所由小鼠中表达Ki-67和PD-1的CD8+ T细胞。e. Vβ8.3、Vβ7和Vβ6在原代、接种或再攻毒小鼠肺中非增殖（PD-1-Ki-67-）和增殖（PD-1+Ki-67+）细胞中的表达比较。h-j, UMAP可视化表达Vβ8.3、Vβ7和Vβ6的CD8+ T细胞。
免疫记忆改变了流感再感染后应答 T 细胞的 TCR 重排和功能状态。这些变化可能是由具有流感特异性 TCR 的记忆 T 细胞形成的，也可能是 T 细胞外在因素造成的，如抗体反应改变了抗原递呈细胞对 T 细胞的引诱作用或减少了病毒载量。因此，作者用流感感染恢复的小鼠的康复血清处理流感感染小鼠，研究了流感抗体对T细胞反应的影响。小鼠呼吸道感染后早期（感染后 4 小时）或疾病症状出现前（感染后 4 天；图 4a）给予血清治疗。聚类分析显示，这些小鼠表现出更低的效应CD8+ T 细胞反应（图 4a-d）。在比较 PD-1+Ki-67+ CD8+ T 细胞中的 Vβ 表达时，感染早期接受血清治疗的小鼠 Vβ8.3+ CD8+ T 细胞的频率增加，而 Vβ6+ 细胞的扩增不再存在（图 4f）。Vβ8.3+ CD8+ T 细胞聚集在 Teff 和 TEM 簇中，与原发感染时一样，没有观察到 TRM 簇的出现（图 4g）。与此相反，Vβ7+ CD8+ T 细胞反应没有因血清转移而改变，似乎与原发性流感感染相同（图 4f、g）。这些结果表明，抗流感抗体会影响 CD8+ T 细胞对感染反应的特异性和分化状态。
图4. 早期康复治疗会限制流感感染期间的 CD8+ T 细胞亚群。a. 用于分析的组别处理。b, UMAP可视化CD8+T细胞。c, 未感染小鼠和流感感染小鼠血清处理后体重变化，占初始体重的百分比。d, CD8+T细胞聚类结果通过热图展示。e. UMAP可视化所由小鼠中表达Ki-67和PD-1的CD8+ T细胞。f. Vβ8.3、Vβ7和Vβ6在血清治疗流感感染小鼠肺中非增殖（PD-1-Ki-67-）和增殖（PD-1+Ki-67+）细胞中的表达比较。h-j, UMAP可视化早期和晚期血清治疗小鼠CD8+ T细胞表达的Vβ8.3、Vβ7和Vβ6。
综上所述，作者鉴定了对李斯特菌和流感的明确抗原有反应的Vα和Vβ表达T细胞的扩增。利用这种策略，发现通过肌肉注射预防性流感疫苗和被动转移康复血清都会导致应答 T 细胞的 TCR Vα 和 Vβ 反应序列及其分化状态发生变化。进一步证明了CyTOF方法的适用性，无需定制试剂或定制生物系统即可研究 T 细胞反应的动态。研究结果推进了对 T 细胞起始和命运决定的理解，指出了改进免疫疗法的方法，并使未来的研究能够使用这种技术来监测 TCR 重排和功能。
[1] Garcia Castillo, Jesse, et al. "A mass cytometry method pairing T cell receptor and differentiation state analysis." Nature Immunology (2024): 1-10.
